הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ"א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.
Abstract
שפעת A הגנום הנגיפי מורכב תחושה שלילית ושמונה, יחיד מולקולות RNA תקועים, ארוזים בנפרד עם מספר עותקים של שפעת nucleoprotein (NP) לחלקיקים ribonulceoprotein ויראלי (vRNPs). VRNPs שפעת מוקפים בתוך מעטפת נגיפיים. במהלך כניסה לתא, לעומת זאת, קומפלקסים אלה vRNP משתחררים לתוך הציטופלסמה, שם הם לקבל גישה מכונות התחבורה גרעיני המארח. על מנת ללמוד את הייבוא הגרעין של vRNPs שפעת שכפול של הגנום שפעת, כדאי לעבוד עם vRNPs מבודד כך רכיבים אחרים של הנגיף לא להפריע לתהליכים אלה. כאן אנו מתארים הליך לטהר אלה vRNPs משפעת וירוס. ההליך מתחיל עם הפרעה של שפעת virion עם דטרגנטים על מנת לשחרר את מתחמי vRNP מ virion אפף. VRNPs מופרדים אז מן המרכיבים האחרים של שפעת virion על שיפוע 33-70% גליצרול רציפה על ידי שקיעה מהירות. שברים המתקבל השיפוע גליצרול מנותחים לאחר מכן צביעה עם Coomassie כחול על דרך עמוד SDS. שברים השיא המכיל NP אז הם אספו יחד מרוכז על ידי צנטריפוגה. לאחר ריכוז, שלמות vRNPs הוא מאומת על ידי הדמיה של vRNPs ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים לאחר מכתים שלילי. טיהור הדרגתי גליצרול הוא שינוי כי מן קמלר<em> Et al.</em> (1994)<sup> 1</sup> ו מכתים השלילי שבוצעה על ידי וו<em> Et al.</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
חלק 1: שיבוש של שפעת Virion הוסף 750 μl של חיץ MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 מ"מ טריס, pH 7.5) לתוך הגליל האחד פוליקרבונט צנטריפוגות Beckman (11 מ"מ x 34 מ"מ) נועדה להשתלב הרוטור TLA-120.2 לשימוש אופטימה Beckman Max-E ultracentrifuge. <li style=";text-align:right;direction:r…
Discussion
טיהור vRNPs מבוסס על ההליך המתואר על ידי קמלר et al. (1994). 1 אנו ואחרים משמשים גם בפרוטוקול זה על מנת לבודד vRNPs ללמוד לייבא הגרעין שלהם. 2,4,5
אנו ממליצים להשתמש RNase ללא טיפים וצינורות כאשר מניפולציה vRNPs כי הגנום הנגיפי מורכ?…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC).
Wu, W. W., Weaver, L. L., Panté, N. Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes. J. Vis. Exp. (24), e1105, doi:10.3791/1105 (2009).