Het genoom van het influenza A-virus bestaat uit acht afzonderlijke complexen van RNA en eiwitten, de zogenaamde virale ribonucleoproteïne complexen (vRNPs). Dit document beschrijft de glycerol gradiënt zuivering en transmissie elektronenmicroscopie visualisatie van influenza A vRNPs.
Abstract
Het influenza A-virale genoom bestaat uit acht negatieve zin, enkelstrengs RNA-moleculen, individueel verpakt met meerdere exemplaren van het influenza A nucleoproteïne (NP) in virale ribonulceoprotein deeltjes (vRNPs). De influenza vRNPs zijn ingesloten in de virale envelop. Tijdens de cel ingang, echter zijn deze vRNP complexen vrijkomen in het cytoplasma, waar ze toegang krijgen tot de host nucleair transport machines. Met het oog op studie van de nucleaire import van influenza vRNPs en de replicatie van het influenza genoom, is het nuttig om te werken met geïsoleerde vRNPs zodat andere onderdelen van het virus niet interfereren met deze processen. We beschrijven hier een procedure om deze vRNPs zuiveren van het influenza A-virus. De procedure begint met de verstoring van het influenza A-virion met detergenten om de vRNP complexen uit de envelop virion release. De vRNPs worden dan gescheiden van de andere componenten van het influenza-A-virion op een 33-70% glycerol discontinue gradiënt door snelheid sedimentatie. De fracties verkregen uit de glycerol gradiënt worden vervolgens geanalyseerd op via SDS-PAGE na kleuring met Coomassie blauw. De piek fracties die NP worden vervolgens gebundeld en geconcentreerd door centrifugeren. Na concentratie, is de integriteit van de vRNPs gecontroleerd door visualisatie van de vRNPs door transmissie elektronenmicroscopie na negatieve kleuring. De glycerol gradiënt zuivering is een wijziging van die van Kemler<em> Et al..</em> (1994)<sup> 1</sup>, En de negatieve kleuring is uitgevoerd door Wu<em> Et al..</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
Deel 1: Verstoring van het Influenza A Virion Voeg 750 ul van de MNT-buffer (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in een Beckman polycarbonaat centrifugebuis (11 mm x 34 mm), ontworpen om in een TLA-120.2 rotor geschikt voor gebruik in een Beekman Optima Max-E ultracentrifuge. Voeg 500 ul van het influenza A virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 stam, 2 mg / ml) in die buis. Meng het virus met de MNT buffer door en neer te pipetteren meerdere malen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 109.0…
Discussion
De zuivering van vRNPs is gebaseerd op de procedure beschreven door Kemler et al.. (1994). 1 Wij en anderen hebben ook gebruikt dit protocol om vRNPs isoleren om hun nucleaire import te bestuderen. 2,4,5
Wij raden het gebruik van RNase-gratis tips en buizen voor het manipuleren van vRNPs omdat het virale genoom bestaat uit RNA, en dus breekt gemakkelijk in de aanwezigheid van RNA. Daarnaast moeten alle buffers worden gemaakt in water dat is RNase vrij. Het prot…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canada Foundation for Innovation (CFI), het Canadese Institute of Health Research (CIHR), en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).
Wu, W. W., Weaver, L. L., Panté, N. Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes. J. Vis. Exp. (24), e1105, doi:10.3791/1105 (2009).