Tradicionalmente, el corte vertical y la preparación de todo el montaje de la retina se han utilizado para estudiar la función de los circuitos de la retina. Aquí se describe la novela de corte método para preservar la morfología dendrítica de neuronas intactas retina.
Abstract
Tradicionalmente, el corte vertical y la preparación de todo el montaje de la retina se han utilizado para estudiar la función de los circuitos de la retina. Sin embargo, muchas de las neuronas de la retina, como las células amacrinas, ampliar sus dendritas horizontalmente, por lo que la morfología de las células se supone que es severamente dañada en los cortes verticales. En la preparación de todo el montaje, sobre todo para las grabaciones de patch-clamp, las neuronas de la retina en la capa del medio no son de fácil acceso debido a la extensa cobertura de las células gliales (células Mueller) endfeets s. Aquí se describe la novela de corte método para preservar la morfología dendrítica de neuronas intactas retina. El corte se hace horizontalmente en la capa interna de la retina, utilizando una máquina de cortar vibratome después de la retina se ha incrustado en la baja temperatura de fusión en gel de agarosa. En esta preparación corte horizontal de la retina, se estudió la función de neuronas de la retina en comparación con su morfología, mediante el uso de patch-clamp grabación, la técnica de imágenes de calcio, inmunocitoquímica, y una sola célula de RT-PCR.
Protocol
Prepare un bloque de agar (30 mg / ml, es decir, un 3%, en agua destilada). Disolver y microondas por primera vez y se vierte en un recipiente de vidrio. Mantenga el recipiente en el refrigerador a 4 º C. Consejo: El bloque de agar deben estar preparados de antemano. Preparar a baja temperatura de fusión en gel de agarosa (25 mg / ml, es decir, un 2,5%, en media). Disolver y microondas. Mantenerlo en el baño de agua caliente a 35 º C. Sugerencia: Mantenga el ge…
Discussion
Hay varias ventajas importantes de la preparación de corte horizontal de la retina.
En primer lugar, la morfología de las células que se expanden horizontalmente dendritas, como las células amacrinas y células horizontales, se conserva. Se ha demostrado que hay más de 20 tipos de células amacrinas de la retina (MacNeil y Masland, 1998), por lo que es muy importante comparar la morfología de las células con las propiedades fisiológicas.
En segundo lugar, en la retina de todo el montaje, la extensa cobertura de las c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Dres. Richard H. Masland y Kaneko Akimichi por darnos consejos y sugerencias para establecer el procedimiento de la preparación de corte horizontal de la retina.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Agar
Sigma
A-1296
Agarose L
Wako
317-01182
Low-temperature melting agarose
Hyaluronidase
Sigma
Type I-S, 300 units/mg
Medium
in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma)