Tradizionalmente la fetta verticale e l'intero montaggio preparazione della retina sono stati utilizzati per studiare la funzione dei circuiti della retina. Qui, descriviamo il romanzo taglio metodo di preservare la morfologia dendritica dei neuroni della retina intatta.
Abstract
Tradizionalmente la fetta verticale e l'intero montaggio preparazione della retina sono stati utilizzati per studiare la funzione dei circuiti della retina. Tuttavia, molti dei neuroni della retina, come le cellule amacrine, espandere le loro dendriti in orizzontale, in modo che la morfologia delle cellule dovrebbe essere gravemente danneggiato le fette verticali. In tutta la preparazione di montaggio, soprattutto per patch-clamp registrazioni, i neuroni della retina nello strato intermedio non sono facilmente accessibili grazie alla vasta copertura di cellule gliali (cellule Mueller) endfeets s. Qui, descriviamo il romanzo taglio metodo di preservare la morfologia dendritica dei neuroni della retina intatta. La fetta è stata fatta orizzontalmente lo strato interno della retina con una affettatrice vibratome dopo che la retina è stato incorporato nella bassa temperatura di fusione gel. In questa preparazione fetta orizzontale della retina, abbiamo studiato la funzione dei neuroni della retina rispetto ai loro morfologia, utilizzando patch-clamp registrazione, la tecnica di imaging del calcio, immunocitochimica, e la cella singola RT-PCR.
Protocol
Preparare un blocco di agar (30 mg / ml, cioè il 3%, in acqua distillata). Sciogliere e forno a microonde è primo e versatela in un piatto di vetro. Tenere il piatto in frigorifero a 4 ° C. Suggerimento: Il blocco di agar deve essere preparato in anticipo. Preparare a bassa temperatura di fusione gel (25 mg / ml, cioè 2,5%, in media). Sciogliere e forno a microonde esso. Tenerlo in bagno d'acqua calda a 35 ° C. Suggerimento: Tenere il gel non troppo caldo….
Discussion
Ci sono diversi vantaggi importanti della preparazione fetta orizzontale della retina.
In primo luogo, la morfologia delle cellule dendriti che si espandono in orizzontale, come le cellule amacrine e le cellule orizzontali, viene mantenuto. E 'stato dimostrato che ci sono oltre 20 tipi di cellule amacrine della retina (MacNeil e Masland, 1998), in modo che sia molto importante confrontare la morfologia delle cellule con la proprietà fisiologiche.
In secondo luogo, in tutto il montaggio della retina, la copertura complet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Richard H. Masland e Akimichi Kaneko per averci dato consigli e suggerimenti validi per stabilire la procedura di preparazione fetta orizzontale della retina.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Agar
Sigma
A-1296
Agarose L
Wako
317-01182
Low-temperature melting agarose
Hyaluronidase
Sigma
Type I-S, 300 units/mg
Medium
in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma)