Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.
Abstract
Mieloide cellule dendritiche (DC) sono spesso usati per studiare le interazioni tra meccanismi immunitari innati e adattivi e la prima risposta alle infezioni. Perché questi sono l'antigene più potenti cellule presentanti l', DC sono sempre più usato come vettore vaccino per studiare l'induzione di risposta immunitaria antigene-specifica. In questo video, dimostriamo la procedura per la raccolta delle tibie e femori da un topo donatore, l'elaborazione del midollo osseo e differenziare DC in vitro. Le proprietà del cambiamento DC a seguito di stimolazione: le cellule dendritiche immature sono fagociti potenti, mentre DC mature sono capaci di presentazione dell'antigene e di interazione con CD4 + e CD8 + T. Questo cambiamento di attività funzionale corrisponde al upregulation dei marcatori di superficie delle cellule e la produzione di citochine. Molti agenti possono essere utilizzati per DC mature, tra cui citochine e Toll-like ligandi del recettore. In questo video, dimostriamo confronti citometria a flusso di espressione di due molecole co-stimolatorie, CD86 e CD40, e le citochine, IL-12, a seguito di stimolazione durante la notte con trattamento di CpG o modelli. Dopo la differenziazione, DC può essere ulteriormente manipolata per l'utilizzo come vettore vaccino o per generare una risposta immunitaria antigene-specifica in vitro utilizzando impulsi peptidi o proteine, o trasdotte con vettori virali ricombinanti.
Protocol
Questo protocollo è stato adattato da Lutz et al 1. Raccolta ed elaborazione di midollo osseo Isolamento della tibia e femore: eutanasia il mouse donatore e spruzzare le gambe con il 70% di etanolo. Afferrare la caviglia prima saldamente con una pinza smussato e cominciare a tagliare via la pelle e la muscolatura sottostante per esporre la tibia. Per evitare di danneggiare l'osso, tagliato lentamente e in parallelo alla tibia, lasciando intatto il …
Discussion
DC sono utili per gli studi di interazioni immune innata e adattativa, e può essere impiegato come vettore di vaccino. In questo video, abbiamo dimostrato i passi per isolare midollo osseo e differenziare cellule dendritiche mieloidi in vitro. Dopo il periodo di coltura, queste cellule possono essere visualizzate sia le cellule al microscopio come aderenti, che spesso possiedono dendriti, e non aderente cellule rotonde. La DC può essere ulteriormente manipolata per la presentazione dell'antigene da pulsante con l'antigene o stimol…
Acknowledgements
JB è sostenuto da borse di studio dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC). Il supporto per questo progetto è stato fornito dal Canadian Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.
Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).