Summary

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

Abstract

הזנה היא תהליך ביולוגי חיוני לצמיחה, רבייה והישרדות של אורגניזם. בדיקה זו נועדה למדוד את צריכת המזון של Caenorhabditis elegans (C. elegans), פרמטר חשוב כאשר לומדים את הגנטיקה של הזדקנות או מטבוליזם. ברוב המינים, האכלה נקבעת על ידי מדידת ההפרש בין כמות המזון שסופקה לבין הכמות שנותרה לאחר מרווח זמן נתון. השיטה המוצגת כאן משתמשת באותה אסטרטגיה כדי לקבוע את האכלה של C. elegans. הוא מודד את כמות החיידקים, מקור המזון של C. elegans, שנוקו תוך 72 שעות. שיטה זו משתמשת בצלחות מיקרוטיטר של 96 בארות ואפשרה סינון של מאות תרופות בשל יכולתן לווסת את צריכת המזון במהירות ובעומק שאינם אפשריים במודלים אחרים של בעלי חיים. כוחה של בדיקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת למדוד האכלה ותוחלת חיים בו זמנית ומודדת ישירות את היעלמות המזון, ולכן מבוססת על אותם עקרונות המשמשים אורגניזמים אחרים, מה שמקל על השוואה בין מינים למינים.

Introduction

Caenorhabditis elegans נמצא בשימוש נרחב בחקר ההזדקנות.  זה היה מודל רב עוצמה לחקור את הגנטיקה העומדת בבסיס חילוף החומרים בתיווך אריכות ימים הנגרמת על ידי הגבלה תזונתית, פעילות מיטוכונדריאלית מופחתת, או איתות אינסולין מופחת. 1,2,3,4,5,6,7. עם זאת, מדידת האכלה בהקשר של אריכות ימים הוכחה כקשה עבור C. elegans בשל גודלו הקטן של בעל החיים 3,8,9,10,11,12,13,14,15.

האכלה היא התנהגות ביולוגית בסיסית הנדרשת להישרדות, והרגולציה ההדוקה שלה נמצאת בליבת השמירה על בריאות מטבולית, רבייה והזדקנות. התנהגות האכלה נשלטת על ידי מסלולי איתות מרובים הן במערכת העצבים והן בפריפריה, ולכן ניתן לחקור אותה רק in vivo 16,17,18,19. האכלה מייצגת את הראשון מבין שלושה עמודי תווך: (i) צריכת אנרגיה, (ii) אחסון אנרגיה, ו-(iii) הוצאות אנרגיה השולטות בהומאוסטזיס האנרגיה של אורגניזם. האכלה ב- C. elegans נחקרה בעיקר על ידי מדידת שאיבת הלוע, כפי שהוגדרה על ידי קצב ההתכווצויות של הלוע. גישה זו סיפקה תובנות מכריעות לגבי התנהגות ההזנה של C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; עם זאת, שאיבת הלוע, הנמדדת במיוחד על פני פרקי זמן קצרים של דקות, אינה בהכרח מתואמת עם צריכת מזון.

צריכת המזון נקבעת לא רק על ידי קצב שאיבת הלוע אלא גם על ידי פרמטרים כגון משך ותדירות התקפי האכלה וצפיפות חיידקי המזון. לבעל חיים עשויה להיות שאיבת לוע גבוהה מאוד, אך אורך התקפי ההאכלה שלו עשוי להיות קצר יותר, ולקזז את הקצב המוגבר. גורם מבלבל נוסף הוא היעילות שבה שאיבה עשויה או לא יכולה לבלוע ולטחון חיידקים. דוגמה קיצונית לשחרור צריכת מזון משאיבת הלוע היא תוספת של סרוטונין ללא נוכחות מזון (חיידקים). בנוכחות סרוטונין אקסוגני, בעלי חיים שואבים בקצב גבוה, אך ללא נוכחות חיידקים, קצב השאיבה הגבוה אינו מוביל לצריכת מזון 2,6,13,22,23.

שיטת פינוי החיידקים שמוצגת כאן מודדת את צריכת המזון של אוכלוסיות תולעים בבארות בודדות כירידה בריכוזי חיידקים לאורך זמן (איור 1). גישה זו דומה לאלה המשמשות במינים אחרים שבהם היעלמות המזון מייצגת מדד לצריכת מזון 10,11,24,25,26,27,28. בפרסום המקורי, תיקפנו שיטה זו למדידת צריכת מזון על ידי הזנת C. elegans עם 15N חיידקים המסומנים באיזוטופ11. מדדים מאוחרים יותר על ידי ספקטרומטריית מסות הראו כי מדידת היעלמותם של חיידקים הייתה בקורלציה חזקה עם התרחשות של תיוג איזוטופים, וחשפה את הספיגה בפועל של החיידקים לתוך החיה11. לכן, אנו בטוחים כי בדיקת פינוי החיידקים מייצגת צריכת מזון ברוב הנסיבות. מטרת הבדיקה אינה להחליף את בדיקת שאיבת הלוע אלא להוסיף לארגז הכלים של בדיקות לחקר הזנה ומטבוליזם ב- C. elegans וכיצד זה קשור להזדקנות ואריכות ימים.

Protocol

איור 1: סכמה של בדיקת פינוי החיידקים. מתווה גרפי של עיקרי הפרוטוקול (מלמעלה למטה): הכנת חיידקים, סנכרון אוכלוסיית התולעים, זריעה בצלחות 96 בארות, עיקור תולעים, הוספת תרופות, מדידת OD600 ביום 1 וביום 4. תיאור מפורט של שלבים ספציפיים אלה מצוין משמאל לכל תיאור. קיצורים: OD = צפיפות אופטית; FUdR = fluorodeoxyuridine. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 1. הכנת חיידקים הערה: סעיף זה מפרט את הכנת חיידקי ההזנה המשמשים בבדיקה זו. זן E. coli הספציפי המשמש בבדיקה נקרא OP50. OP50 הוא הזן הנפוץ ביותר להזנת C. elegans. זן OP50 בו נעשה שימוש עמיד בפני קרבניצילין/אמפיצילין, המונע זיהום צולב של תרבית התולעים עם חיידקים אחרים9. יש להכין את OP50 4-5 ימים מראש, ולהקרין קרני רנטגן יום לפני השימוש. ודא שכל החומרים הנתקלים ב-OP50 הם סטריליים 29,30. יום -8: יום רביעי (שבוע 1):הכינו את הפרה-אינוקולום על ידי חיסון 5 מ”ל של LB עם 100 מיקרוגרם/מ”ל אמפיצילין ו-0.1 מיקרוגרם/מ”ל אמפוטריצין B, ומושבת OP50 אחת ודגרו במשך כ-6 שעות ב-37°C בשייקר חיידקי. יש לחסן מוקדם כדי לאפשר צמיחה מספקת לתרבות להיות מעונן. ברגע שהתרבית מעוננת, יש לדלל את תרבית הפרה-אינוקולום של OP50 ביחס של 1:2,000 ב-250 מ”ל שחפת המכילה 100 מיקרוגרם/מ”ל אמפיצילין. לדגור על התרבית לילה בשייקר חיידקי במשך 17-19 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.הערה: אין לאפשר לתרבות לגדול יותר מ-19 שעות. יום -7: יום חמישי (שבוע 1)לאחר הדגירה של 17-19 שעות, העבירו את התרבית הנוזלית OP50 לצינור צנטריפוגה סטרילי וצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-3,100 × גרם בצנטריפוגה שולחנית ב-4°C. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את כדורית OP50 במים סטריליים והפעילו מחדש צנטריפוגה. חזור על כביסה זו 2x. לאחר השטיפה השנייה, להשליך את supernatant, להשעות מחדש את כדור OP50 במים סטריליים לנפח של 50 מ”ל ולהעביר אותו צינור חרוטי מראש 50 מ”ל. הטיל את OP50 על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 3,100 × גרם בצנטריפוגה שולחנית ב 4 ° C. לאחר השטיפה השלישית, הסירו בזהירות את כל הסופרנטנט שנותר, וודאו שלא נותרו מים בצינור. חישוב משקל הגלולה על ידי הפחתת משקל צינור הצנטריפוגה הריק ממשקל צינור הצנטריפוגה עם הכדור.הערה: משקלי הגלולה נעים בדרך כלל בין 3-3.5 גרם. יש להשהות מחדש ביסודיות את כדורית OP50 במאגר S-Complete לריכוז של 100 מ”ג/מ”ל, כדי לוודא שאין גושים. ודא כי הריכוז של OP50 ב 100 מ”ג / מ”ל מתאים 2 × 1010 חיידקים / מ”ל. אם הקשר בין הצפיפות האופטית למספר החיידקים למ”ל ידוע, יש לקבוע את ריכוז החיידקים למ”ל באופן ספקטרופוטומטרי. במידת הצורך, השתמש במאגר S-complete כדי להתאים את ריכוז תמיסת ההזנה OP50 ל- 2 × 1010 חיידקים/מ”ל. בדוק את OP50 על צלחת אגר כדי לקבוע אם הוא היה מזוהם. אחסן את OP50 תלוי במאגר S-complete בטמפרטורה של 4°C. יום -3: יום שני (שבוע 2)להרוג את החיידקים באמצעות הקרנת רנטגן כדי למנוע צמיחת חיידקים במהלך הבדיקה. 2. הכנת תרבית תולעים סינכרונית הערה: סעיף זה דן בהכנת אוכלוסיית תולעים סינכרונית. כל החומרים הבאים במגע עם אוכלוסיות התולעים הם סטריליים. כל הצלחות נשמרות בטמפרטורה של 20°C אלא אם כן נאמר אחרת. יום 6-: יום שישי (שבוע 1), 16:00מעבירים את החיות לצלחת טרייה.קחו לדוגמה צלחת NGM שעליה מורכבת רוב אוכלוסיית התולעים מזחלי L1 מורעבים.הערה: גם אוכלוסייה מעורבת תניב תוצאות. שימוש בתולעי L1 שהורעבו במשך זמן רב עשוי להשפיע על התנהגות האכילה בדורות הנוכחיים או הבאים, שכן רעב יכול להשאיר סימנים אפיגנטיים במשך שלושה דורות לפחות. לשטוף את התולעים עם לא יותר מ 1 מ”ל של מים סטריליים. Aliquot ~ 300 μL של אוכלוסיית התולעים שנשטפו על לוחות NGM שנזרעו עם OP50 מרוכז (~ 300 מ”ג / מ”ל). הניחו לצלחות להתייבש תחת מייבש צלחות או מבער בונזן. דוגרים על הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שרוב האוכלוסייה מכילה בוגרים כבדים (יום שני).הערה: מסגרת זמן זו מותאמת לאוכלוסיית תולעי N2 מסוג בר ועשויה להשתנות מזן לזן. יש לקחת בחשבון תולעים עם עיכוב התפתחותי ולקבץ אותן מוקדם יותר ו/או לזרוע אותן מוקדם יותר, כך שכל הזנים שנבדקו יגיעו לבגרות בו זמנית. יום 3-: יום שני (שבוע 2) 10:00 בבוקרהקמת אוכלוסייה סינכרוניתזהירות! אקונומיקה היא חומר מאכל לעור ולעיניים. הטיפול בו דורש כפפות ומשקפי בטיחות.לאסוף תולעים על ידי שטיפתם מהצלחת עם עד 10 מ”ל של מים סטריליים. העבירו את תמיסת התולעת/מים לצינור חרוטי בנפח 15 מ”ל. שטפו את התולעים בכיור הכבידה על ראש הספסל במשך כ-4 דקות (לעומת זאת, שטפו בצנטריפוגה במשך 2 דקות בצנטריפוגה שולחנית ב-310 × גרם). יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות שאיפה בעזרת קצה קטן ולהוסיף עד 15 מ”ל מים סטריליים. חזור על הפעולה 3x. הסר את supernatant ולהוסיף 5 מ”ל של תמיסת אקונומיקה/NaOH טרייה (1.8 מ”ל של אקונומיקה ביתית, 0.5 מ”ל של 10 N NaOH, 7.7 מ”ל של dH2O). יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר או עד שהתולעים נפתחות. מערבבים בעדינות כל דקה במשך 10 שניות לפחות. עקוב אחר ההתקדמות תחת המיקרוסקופ המנתח.הערה: הזמן הדרוש כדי לפתוח את התולעים עשוי להשתנות מזן לזן. השארת התולעים בתמיסת האקונומיקה זמן רב מדי עלולה לגרום לביצים שאינן בנות קיימא. הוסף חיץ M9 כדי לנטרל את התגובה ברגע שכל המבוגרים נפתחים או מתמוססים (נפח סופי להיות 15 מ”ל) וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב 1,300 × גרם. לשטוף את הביצים 3x עם 13 מ”ל של חיץ M9. שטפו את הביצים פעם אחת עם 10 מ”ל של חיץ S שלם על ידי צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 1,300 × גרם. שואפים את הסופרנטנט, מוסיפים 10 מ”ל של S-complete, ומעבירים את המתלה לצינור חרוטי טרי של 15 מ”ל. סובבו בעדינות את הצינור בטמפרטורת החדר למשך הלילה על נוטטור או מכשיר דומה. אופציונלי: אם קיימים פגרים בוגרים לאחר צנטריפוגה סופית במאגר S-שלם, סנן את תמיסת התולעת דרך מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר. יום 2-: יום שלישי (שבוע 2), 13:00זריעת החיות לצלחותבאמצעות טווח ניתוח, בדוק אם התולעים בקעו. לקבוע את ריכוז התולעים במאגר S-complete על ידי ספירת אוכלוסיית התולעים בטיפות 10 μL באמצעות טווח ניתוח; ספרו 5-10 טיפות לכל דגימה. אם ריכוז התולעים בכל טיפה של 10 מיקרוליטר עולה על 30 תולעים לטיפה, יש לדלל את המלאי הכולל עם S-Complete לצפיפות תולעת נמוכה יותר בכל טיפה כדי להקל על הספירה. זרעו את תערובת התולעים הנוזלית בכל באר של צלחת בת 96 בארות בנפח של 120 μL כדלקמן (ריכוזים סופיים): 60 תולעים/מ”ל ב-S-complete, 50 מיקרוגרם/מ”ל Carbenicillin, 0.1 מיקרוגרם/מ”ל Amphotericin ו-6 מ”ג/מ”ל OP50 שהוכנו בסעיף 1.הערה: הנפח הכולל שיש להכין תלוי במספר הצלחות (~ 12 מ”ל לכל צלחת 96 באר). צריך להיות 6-12 תולעים בכל באר. לחלופין, ניתן להשתמש בציטומטריית זרימת חלקיקים גדולה, כגון COPAS FP של Union Biometrica, כדי למיין במדויק 10 תולעים לכל באר (ראה סעיף אפקט צפיפות). כלול גם תערובת נוזלית ללא תולעים : 50 מיקרוגרם / מ”ל של Carbenicillin, 0.1 מיקרוגרם / מ”ל Amphotericin, ו 6 מ”ג / מ”ל של OP50 מוכן בסעיף 1. שים 120 μL של תערובת ללא תולעים בשורה H של צלחת 96-באר, אשר משמש כדי לקבוע את ערכי selflysis, כאמור. שים 120 μL לכל באר של תערובת עם תולעים בשורות A-G.הערה: ודאו שהתולעים נשמרות בתרחיף במהלך הצנרת (ראו איור 2A, B). אנו משתמשים בצלחות שקופות 96 בארות עם תחתית שטוחה. פריסת הלוחות שלנו מחלקת את הצלחת כדי ליצור 4 או 6 תנאים שבהם כל זוג עמודות יהיה טיפול תרופתי שונה או זן תולעת שונה, והשורה התחתונה תשמש כבקרה “ללא תולעת” (איור 2A, B). כדי למנוע זיהום ואידוי, אטמו את הצלחת עם סרט איטום. לדגור על הצלחות במשך כ 65 שעות ב 20 ° C עד החיות להיות תולעים L4. יום 0: יום חמישי (שבוע 2) לפני הצהריים.עיקור אוכלוסיית התולעים באמצעות תוספת של Fluorodeoxyuridine (FUdR).הוסף 30 μL של תמיסת מלאי FUdR של 0.6 mM כדי לעקר את בעלי החיים בכל באר. אטמו מחדש את הצלחת באמצעות אטמי סרטים ונערו את הצלחות למשך 20 דקות על שייקר צלחת מיקרוטיטר ב-800 סל”ד. החזירו צלחות לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס.הערה: בשלב זה, ריכוז OP50 הסופי מופחת מ-6 מ”ג/מ”ל ל-5 מ”ג/מ”ל (1 × 109 חיידקים/מ”ל), ולכל באר יש נפח סופי של 150 מיקרוליטר. חשוב להוסיף FUdR לשלב L4 לפני שהחיות מגיעות לבגרות. יום 1: יום שישי (שבוע 2)להוסיף סמים לתרבות.עד השעה 9:00 בבוקר, אשרו שרוב בעלי החיים הם גרבידים וכל באר מכילה כמה ביצים. במידת הצורך, להוסיף תרופות כלשהן לריכוז הרצוי (ראה דיון). לאחר הוספת התרופה, אטמו את הצלחות עם סרט איטום ונערו את הצלחות למשך 20 דקות ב-800 סל”ד על שייקר צלחת.הערה: הרעידה מבטיחה שכל גושי החיידקים יומסו מבלי לגעת באוטם. גם גושי חיידקים וגם נוזל על האטם יעוותו את קריאת OD600 . אם טיפות נוזל נמצאות על האוטם, סובבו אותו בקצרה במשך 10-20 שניות ב 310 × גרם. נערו שוב על השייקר במשך 5 דקות ומדדו. לאחר 20 דקות של טלטול על שייקר צלחת microtiter, להסיר את המכסה ואת האטם ולמדוד את OD600 בקורא לוחות; זוהי מדידת יום 1 OD600 . אוטמים ומחזירים צלחות לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס.הערה: מאחר שחיידקים מתיישבים במהירות, הקריאה אמורה להתרחש תוך 10 דקות לאחר ניעור הלוחות. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את אוכלוסיית התולעים עבור סימנים של זיהום או רעילות אם תרופה נוספה . מחזירים את הצלחות לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס. יום 4: יום שני (שבוע 3)קח את יום 4 OD600 קריאה.חזור על הליך הקריאה מהיום הראשון (שלב 2.5.1.3) כדי לקבל את הערך Day 4 OD600 . לפני מדידת OD600 , נערו את הצלחות במשך 20 דקות ב-800 סל”ד בשייקר צלחת המיקרוטייטר. במיקרוסקופ הפוך, עם מטרה אידיאלית פי 2, ספרו את אוכלוסיית התולעים בכל באר ותיעדו אותה בגיליון אלקטרוני. מחזירים את הצלחות לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס לאחר הספירה.הערה: ראה דוגמה של גיליון הניקוד שלנו המסופק בחומר משלים. לאחר קריאת יום 4 , מדידות צריכת המזון הושלמו. במידת הצורך, שמור לוחות אלה לניתוח תוחלת חיים.הערה: פרוטוקול זה תואם ל-Solis ול-Petrascheck31. 3. ניתוח נתוני צריכת מזון איור 2: תכנון וניתוח. (A, B) עיצובי לוחות אפשריים עבור 4 ו -6 תנאים עם בארות הבקרה “ללא תולעת” בשורה H. בארות אלה נחוצות כדי לקבוע את שיעור הליזה העצמית. בכל לוחית, תמיד לכלול אוכלוסיית ביקורת N2 לא מטופלת כנקודת התייחסות. (C) נתונים לדוגמה שנאספו בגיליון האלקטרוני שסופק עם מספר התולעים (תיבה ירוקה), שני המדדים OD600 בימים 1 ו- 4 (תיבות כתומות), ערכי העצמיזציה (תיבה כחולה) וההערכה באמצעות נוסחה (2) ((OD600 -selflysis)/X0) בתיבה האדומה. הדוגמה הספציפית המוצגת כאן משתמשת בעיצוב הלוח המוצג ב- (B). קיצורים: OD = צפיפות אופטית; X0 = מספר התולעים לבאר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הערה: סעיף זה מתאר כיצד מנתחים את נתוני צריכת המזון מסעיף 2 של פרוטוקול זה. הערכים הראשונים שיש לחשב הם ערכי השליטה העצמית . חיידקים ליז לאורך זמן בנוזל, גם בהיעדר תולעים. ערך זה של עצמיות יכול להיות מושפע גם מכימיקלים רבים ויש לשלוט בו מכיוון שהוא גדול יחסית לצריכת המזון של התולעת. כפי שמתואר בשלב 2.3.1.4 ומוצג בפריסת הלוחות באיור 2A, B, שורה H מכילה את אותה תמיסה, למעט התולעים. במערך הלוחות שלנו שמוצג באיור 2B, יש 14 בארות בכל מצב עם שתי בארות בקרת עצמיזציה בהתאמה (שורה H, “ללא תולעים”). חשב את ערכי הבקרה העצמית עבור בארות הבקרה ללא תולעים בכל מצב באמצעות משוואה ( 1). עבור כל קבוצת בארות משוכפלות, ודא שיש לפחות שתי בארות להדברת תולעים , כפי שהוזכר בשלב 2.3.1.4. השתמש בממוצע מכל בארות הבקרה ללא תולעים עבור ערך העצמיזציה עבור קבוצה משוכפלת.Selfysis = mean(OD600 יום 1 – OD600 יום 4) (1)הערה: עבור הגדרת הלוחות המוצגת באיור 2B, היינו מחשבים שישה ערכי selflysis , אחד עבור כל אחת משש הקבוצות, על-ידי חישוב הממוצע של שתי בארות הבקרה העצמיות בשורה H. חישוב צריכת המזון לכל תולעת באמצעות משוואה     (2).הערה: נוסחה המשמשת בגיליון האלקטרוני (תיבה אדומה, איור 2C) כאשר X0 הוא מספר התולעים לכל באר. לאחר צריכת המזון לכל תולעת נקבעת עבור כל באר, לחשב את הממוצעים ואת סטיית התקן עבור המצב כולו.הערה: עבור הגדרת הלוחות המוצגת באיור 2B, 14 בארות משוכפלות לכל תנאי מספיקות להשוואות סטטיסטיות. לנרמל כל מצב לאוכלוסיית הבקרה הלא מטופלת N2 המתאימה לו. ציין את השינוי בהזנה כשינוי קיפול או אחוז האכלת N2.הערה: הנורמליזציה מתבצעת מכיוון שהערכים המוחלטים של OD600/X0 מהמשוואה (2) יכולים להשתנות בין ניסויים שנערכו בימים שונים.

Representative Results

תרשים 3: נתונים מייצגים. (A) הגרף מציג עקומות מנה-תגובה של שינוי קפל בצריכת המזון כפונקציה של ריכוז הסרוטונין. כל הנתונים מראים צריכת מזון בסיסי לא מגורה מנורמל להזנה בסיסית N2. שימו לב שבעלי החיים מסוג daf-16(mu86) אוכלים יותר מבעלי חיים מסוג N2 פראי כאשר לא נוסף סרוטונין, אך מראים טווח קהה ביכולתם לשלוט בהאכלה. (B) גרף מראה תרשים כינור של שינוי קפל בצריכת המזון של תולעים שטופלו ב-50 מיקרומטר של לוקספין האנטי-פסיכוטי אך ניזונו מחיידקים שהומתו על-ידי קרני רנטגן, קרני γ או פרפורמלדהיד (C) גרף מראה תרשים כינור של שינוי קפל בצריכת המזון של מוטנטים שונים עם הגנוטיפים שלהם המסומנים בציר ה-x. נתונים אלה מצביעים על כך שמוטנטים exc-4 ו-cgr-1 אוכלים פחות, בעוד שמוטנטים של srp-6 אוכלים יותר. כוכביות מייצגות ** p < 0.001, ****p < 0.0001 כפי שנקבע על ידי ANOVA ובראון-פורסיית-וולש, מתוקן פוסט-הוק כדי להסביר בדיקות השערות מרובות. קווי שגיאה מציגים את ±S.E.M. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 1 מדגיש את זרימת העבודה הכוללת של פרוטוקול זה. הוא ממחיש את התהליך כולו, החל מייצור החיידקים ועד לרכישת קריאת OD600 ביום הראשון וביום הרביעי. בנוסף, האינפוגרפיקה מפנה לשלבים הספציפיים של השיטות בהן נעשה שימוש. איור 2A, B מראה שתי פריסות אפשריות של לוחות ניסיוניים, כולל בארות בקרה “ללא תולעים” בשורה H, הנחוצות לחישוב שיעורי הליזה העצמית המתוארים בסעיף הדיון. מניסיונה של המעבדה שלנו, הכרחי שאחד התנאים לא יטופל בבקרת N2 כדי להסביר את השונות של צריכת חיידקים של תולעים שנצפתה בין ניסויים (ראו דיון: תכנון [אוכלוסיית ייחוס N2]). איור 2C הוא דוגמה לגיליון האלקטרוני המשמש לניתוח הנתונים שנוצרו בפרוטוקול זה. זה מדגיש את ספירת התולעים בירוק, selflysis בכחול, יום 1 OD600 ויום 4 OD600 בכתום, ואת צריכת המזון לכל תולעת באדום. בנוסף, כל באר נמצאת במעקב אחר הזן, התרופה, הריכוז, תאריך הניסוי וטיפולים אחרים שנוספו. מידע נוסף על המשוואות הספציפיות בהן נעשה שימוש ניתן למצוא בסעיף 3 של הפרוטוקול. בסך הכל, גיליונות אלקטרוניים אלה (תבנית המסופקת כחומרים משלימים) מספקים איסוף וניתוח נתונים יעילים של פרוטוקול זה. איור 3A מראה תוצאות מייצגות עבור עקומת מנה-תגובה של האופן שבו סרוטונין מווסת את ההזנה במוטציות N2 ו-daf-16 באמצעות פרוטוקול זה. בניסוי זה, השינוי בקיפול מצריכת המזון הבסיסי (הנקודה הראשונה בעקומה) חושב על פני חמש מנות הולכות וגדלות של סרוטונין. כפי שתוצאות אלה מדגישות, זן N2 מסוגל לאכול יתר על המידה באופן תלוי מינון. עם זאת, עבור מוטציית daf-16(mu86), למרות שההזנה הבסיסית גבוהה מ-N2, המוטנט אינו יכול להגיב לסרוטונין באותו אופן תלוי מינון כמו זן N2. פרוטוקול זה מאפשר לנו לקבוע את התנהגות ההזנה בין שני זנים שבהם ריכוז הסרוטונין היה הגורם המשתנה ליצירת עקומות מנה-תגובה. איור 3B מראה את צריכת המזון של תולעים שטופלו בלוקספין האנטי-פסיכוטי אבל ניזונו מחיידקים שנהרגים על-ידי קרני רנטגן, קרני γ או פרפורמלדהיד. יש לציין כי ניסויים אלה לא נערכו במקביל וכי ההבדלים אינם מייצגים את השיטות השונות להרוג את החיידקים אלא נובעים משונות בין ניסויים. איור 3C מראה את צריכת המזון של סדרה של זנים גנטיים, כאשר שני זנים מראים ירידה וזן אחד מראה עלייה בהתנהגות ההזנה ביחס ל-N2. יישום זה של הפרוטוקול מאפשר בדיקה של תרופה אחת בריכוז אחד על פני רקעים גנטיים שונים. הוא מתאים לזיהוי רקע גנטי המציג תגובת צריכת מזון שונה מזו של קבוצת ביקורת מסוג N2 פראי כאשר ניתנת אותה תרופה. ניתן לשלב אותו עם פרוטוקול תוחלת החיים שלנו כדי לסנן במהירות את צריכת המזון ואת תוחלת החיים באותה צלחת31. חומר משלים: תבניות גיליון אלקטרוני המוצגות באיור 2C. אנא לחץ כאן כדי להוריד חומרים אלה.

Discussion

הפרוטוקול שהוצג מודד פינוי חיידקים כקריאה לצריכת מזון של C. elegans בצלחות מיקרוטיטר של 96 בארות. עקומות המינון-תגובה בסעיף התוצאות המייצגות מראות כי הבדיקה מודדת כמותית את צריכת המזון, רעיון שאושר באופן עצמאי באמצעות חיידקים המסומנים באיזוטופים11. באמצעות בדיקה זו, בדקנו בהצלחה תרופות שאושרו על ידי ה- FDA כגון תרופות אנטי פסיכוטיות עם תופעות לוואי מטבוליות ידועות בבני אדם והראינו כי תרופות אלה הגבירו את ההזנה ב– C. elegans10,26. הבדיקה שימושית לחקר הגנטיקה או הפרמקולוגיה של האכלה ומוסיפה כלי חדש למחקר C. elegans לחקר חילוף החומרים. בדיקה זו מספקת שיטה בעלות נמוכה לחקר האכלה באופן מדרגי וידידותי לזמן, דבר שאינו אפשרי ברוב האורגניזמים האחרים. העבודה שלנו על תרופות שאושרו על ידי ה- FDA מראה כי תופעות לוואי רבות שנצפו בחולים אנושיים נצפות גם ב- C. elegans, וחושפות שימור אבולוציוני 24,26,32.

הבדיקה מוגבלת על ידי ריכוז החיידקים שניתן למדוד בטווח הליניארי של מדידת OD600 . כתוצאה מכך, מספר התולעים וטווח ריכוזי החיידקים שניתן לבדוק מוגבלים. יותר מדי תולעים ישפיעו על OD600 על ידי צריכת החיידקים מהר מדי, ולכן “אוכלות” את ריכוז החיידקים מתוך OD600 ליניארי. מניסיוננו, שונות בהכנת חיידקים היא הפרמטר הקריטי שגורם לתוצאות להשתנות מניסוי אחד למשנהו. ניסינו ללא הצלחה להקפיא קבוצות גדולות של חיידקים או להשתמש בחיידקים ליופיליים. במקרים אלה, או שקצב הליזה העצמית נעשה גבוה מדי, או שהחיידקים היו באיכות שהאטה את התפתחות C. elegans . עם זאת, הבדיקות שלנו לא היו ממצות, ובעיה זו עשויה להיות פתירה.

באופן כללי, קצב העצמיזציה של החיידקים הוא המאתגר ביותר לשליטה, והוא יכול לגרום לשונות ניכרת. מצאנו כי תרופות מסוימות יכולות להגדיל את שיעור העצמיזציה לרמות שהבדיקה לא הצליחה לקבוע באופן מהימן את צריכת המזון. מכיוון ששיעור העצמיזציה עולה עם הזמן בבדיקה, לא מדדנו את צריכת המזון מעבר ליום 5 לבגרות. בגיל זה, החיידקים נמצאים ~ 10 ימים בתרבית. כדי למדוד את צריכת המזון מעבר ליום 5 לבגרות, יש לשטוף את החיידקים הישנים ולהחליפם בחיידקים טריים.

הבדיקה המוצגת היא הרחבה של בדיקת תוחלת החיים31 המבוססת על לוחות מיקרוטיטר 96 בארות. שילוב זה מאפשר למדוד תוחלת חיים וצריכת מזון באותה אוכלוסייה. בעוד שבדיקת פינוי החיידקים המוצגת כאן אינה מאפשרת לקבוע את צריכת המזון לאורך כל חייו של C. elegans עקב עצמיות חיידקית, היא מספקת נתונים מוצקים עבור ארבעת הימים הראשונים של הבגרות, הזמן עם צריכת המזון הגבוהה ביותר. במיוחד עבור גילוי תרופות מולקולות קטנות, שליטה על צריכת מזון היא חיונית. לסיכום, אנו צופים כי המחקר המוצג יהיה שימושי לקהילת C. elegans וירחיב את סט הכלים לחקר חילוף החומרים או שליטה בו בהקשר של מחקרי הזדקנות ותוחלת חיים.

תכנון:

לפני שמתכננים למדוד את צריכת המזון, יש לקחת בחשבון מספר שיקולים.

הרג החיידקים:

אנו הורגים חיידקים על ידי הקרנה באמצעות קרני רנטגן בצינור חרוטי של 50 מ”ל (900 אפור למשך 4 שעות שנקבע על 160.0 קילו-וולט ו-25.0 מיליאמפר). אנו משתמשים ב-RS2000 של Rad Source להקרנה. בהתאם לציוד, הזמן הספציפי ומינון הקרינה עשויים להשתנות ממתקן למתקן. ההרג המלא של החיידקים צריך להיקבע על ידי ציפוי החיידקים לאחר הקרנה כדי לזהות ניצולים על ידי גדילה. זה חיוני כדי להרוג את כל החיידקים כדי למנוע צמיחה במהלך הבדיקה, כמו זה יגרום הערכת חסר של האכלה או אפילו ערכי האכלה שליליים. חשוב לציין שיש להרוג את החיידקים כדי ש-C. elegans עדיין יאכלו אותם. מניסיוננו, ישנן שלוש דרכים להרוג כמויות גדולות של חיידקים באופן אמין: (i) הקרנה באמצעות קרני רנטגן, (ii) על ידי γ-rays, ו-(iii) תוספת של פורמלדהיד29,30. שיעורי הליזה העצמית בין שלוש השיטות האלה דומים, עם מקדם שונות של 8% בין שיעורי הליזה העצמית בניסויים שמוצגים באיור 3B. שיטות שלא עבדו בידינו בצורה אמינה היו הקרנת UV, קוקטיילים אנטיביוטיים, נטרול חום ונתרן אזיד. שיטות אלה אינן מצליחות להרוג לחלוטין את החיידקים (UV ואנטיביוטיקה), מייצרות חיידקים ש– C. elegans אינו אוכל (חום), או משנות את צריכת המזון (נתרן אזיד).

מספר עותקים משוכפלים:

מניסיוננו, שינויי הקיפול בהאכלה הם בדרך כלל קטנים בהשוואה לשונות הנצפית. לפיכך, מדידת שינויים בצריכת המזון דורשת מספר בארות משוכפלות. איור 2A,B מראה לוחות של 96 בארות שתוכננו עבור ארבעה או שישה תנאים שונים, עם 21 או 14 בארות משוכפלות ושתי בארות לשליטה עצמית ללא תולעים. בהתחשב בשונות הגדולה ובשינויים הקטנים יחסית הצפויים, שינויים של פי 0.5-2.5 בהאכלה נוטים להיות הגבול התחתון והעליון. אנו ממליצים על 14 עד 21 בארות משוכפלות לכל מצב ולפחות שתי בארות בקרת עצמיות, המתוארות בהמשך. שכפולים אלה מספיקים כדי ליצור עקומות מנה-תגובה כמותיות עבור תרופות המשנות את ההזנה11,26.

שליטה בלליזה עצמית:

OD600 מודד את מספר החלקיקים בתמיסה, לרוב ללא תלות בגודל החלקיקים. עם זאת, חיידקים מתים ישככו, ויאבדו את טבע החלקיקים שלהם. אנו קוראים לזה selflysis, אשר מתרחשת באופן עצמאי בנוכחות תולעים ומורידה את מדידות OD600 ללא התולעים לאכול. ליזה עצמית מתרחשת במהלך הבדיקה ויש למדוד אותה באופן עצמאי לפחות בשתי בארות לכל מצב. בארות אלה מקבלות את אותו הטיפול כמו האחרות באותו מצב, אלא שהן אינן מכילות תולעים. מצאנו כי תרופות רבות יכולות גם לשנות את שיעור העצמיזציה. לכן, כל מצב צריך בארות שליטה עצמית עצמאית עם הריכוז שלהם. איור 2 מראה מערך לוחות עבור ארבעה או שישה תנאים עם כל בארות הבקרה של הליזה העצמית בתחתית הצלחת בשורה H.

אוכלוסיית ייחוס N2:

כמו כן, ציינו כי הכמות האבסולוטית של החיידקים הנצרכת יכולה להשתנות בין ניסויים, ככל הנראה הקשורים לאיכות החיידקים. למרות מיטב מאמצינו להכין אותם בדיוק באותו אופן בכל פעם, יש תנודות. לדוגמה, ניתן לקצור חיידקים במצב חלוקה בשלב הגידול הלוגריתמי, ולכן להיות גדולים בהרבה מחיידקים שנקצרו בשלב הנייח. לפיכך, הבדלים פשוטים אלה בגודל החיידקים יכולים להוביל לשינויים במספר החיידקים הנצרכים ולערכי OD600 שונים מכיוון שמדידות OD600 אינן מבחינות בין גדלים. מסיבה זו, אנו תמיד כוללים אוכלוסייה אחת של חיות ביקורת N2 לא מטופלות המשמשות כערך ייחוס, המוגדר ל-1 או 100%, כדי לקבוע אם קבוצות הניסוי אוכלות יותר או פחות מקבוצת הבקרה N2. פרקטיקה זו מאפשרת השוואה בין ניסויים, גם אם ערכי OD600 משתנים.

מרווחי זמן:

שימוש בערכי OD600 למדידת צריכת מזון דורש ירידה ניכרת בריכוז החיידקים. מכיוון שנפח התרבית גדול בהרבה מהתולעים, הן חייבות לאכול כמות משמעותית של חיידקים כדי לחולל שינוי שניתן להבחין בהן. הישארות בטווח הליניארי של ערכי OD600 דורשת שריכוז החיידקים יישאר בין ~1 מ”ג/מ”ל ל-10 מ”ג/מ”ל, כך שכמות ניכרת של חיידקים חייבת להיעלם כדי לזהות אותו. תולעים אוכלות הכי הרבה מסוף L4 עד יום 4 לבגרות בגלל ייצור ביצים. לכן, מרווח זה הוא אידיאלי. מרווחי זמן קצרים יותר כמו 24 שעות ניתן למדוד11, אבל זה הרבה יותר קשה וצריך ~ 40 בארות לכל מצב. אפשרות נוספת למדוד את צריכת המזון של הזחלים היא להכפיל את מספר בעלי החיים בכל באר. עם זאת, הבעיה עם גישה זו היא כי יותר מדי תולעים יתחילו להשפיע על קריאות OD600 כאשר הם גדלים.

פתרונות מלאי לתרופות שייבדקו:

אם תרופות כגון סרוטונין נבדקות על יכולתן לווסת את ההאכלה, שקול את הדברים הבאים בעת הכנת פתרונות מלאי. בדרך כלל אנו מכינים מלאי של פי 50 לתרופות מסיסות במים ומוסיפים 3 מיקרוליטר לכל באר (1:50), אך גם ריכוזי מלאי אחרים (100x, 300x) עובדים. עם זאת, אם התרופות מדוללות בממסים שאינם מים (למשל, DMSO), הריכוז הסופי לא יעלה על 0.5%. ממסים הופכים במהירות מזיקים ל – C. elegans. לפיכך, תמיסות מלאי של תרופות המומסות בממסים אורגניים כגון DMSO חייבות להיות פי 300 ומעלה.

ניקוד תולעים חיות ומתות:

הקביעה של בעלי חיים חיים ומתים מבוססת על תנועת התולעת. אור חזק, במיוחד אור כחול, משמש כי זה גורם לבעלי החיים לנוע. יתר על כן, ניקוד מספר בעלי החיים בכל באר יגלה אם יש מקרי מוות עודפים. מקרי מוות עודפים יכולים להתרחש עם חומרים רעילים או ריכוזים גבוהים (>0.5%) של מספר ממסים, כולל DMSO. באופן כללי, צריכים להיות פחות מ 1:100 (1%) בעלי חיים מתים. ניתן לנער צלחות במשך 30 שניות ב 800 סל”ד על שייקר צלחת microtiter אם האוכל התיישב האוכלוסייה הופך להיות קשה לספור. התעלם מבארות עם זכרים או יותר מ -16 תולעים (ראה בעיות).

בעיות אפשריות:

טלטול לא מספק:

בתווך נוזלי, חיידקים יכולים בקלות להתקבץ יחד ולהתיישב בתחתית הבארות. מניסיוננו, טלטול של פחות מ-20 דקות עלול שלא לפרק גושי חיידקים ולהשהות אותם מחדש, מה שיגרום למדידות OD600 לא מדויקות. מדידות OD600 בנוכחות גושי חיידקים ימעיטו בריכוז החיידקים. הגדרות שייקר מוגזמות עלולות לגרום להידבקות הנוזל לאיטום. לאחר הסרת חומר האיטום לקריאת OD600 , הנוזל שנדבק לאוטם יגרום לקריאת OD600 נמוכה יותר. אם יש נוזל על האטם, סובבו במהירות את הצלחת במהירות נמוכה (500-1,000 סל”ד) ונערו שוב במשך 5 דקות. יתר על כן, יש לוודא, כאמור לגבי הקריאות ביום 1 וביום 4, לקרוא תוך 10 דקות מניעור הצלחות כדי למנוע מהחיידקים לשקוע.

ערכי צריכת מזון מוחלטים שונים בין ניסויים:

למרות מיטב מאמצינו לתקנן את התכשירים החיידקיים, לעתים קרובות הם שונים בדרכים המשפיעות על צריכת המזון בתולעים. לדוגמה, בשל מצב החלוקה שלהם, חיידקים נבדלים בגודלם בהתבסס על האם הם נקטפו בשלב הגידול הלוגריתמי או בשלב הנייח, כאשר החיידקים הלוגריתמיים גדולים יותר. בשל מדידות OD600 שאינן מבחינות בין הגדלים, ההבדלים בגודל החיידקים עקב השלב שבו נקצר החיידק עשויים להוביל להבדלים לכאורה שנצפו בצריכת המזון הבסיסית בין תכשירים חיידקיים. הדרך הטובה ביותר להשוות בין ניסויים היא תמיד לכלול אוכלוסיית ביקורת N2 לא מטופלת ולנרמל את התוצאות לאוכלוסיית N2 זו.

השפעות צפיפות:

ריכוז החיידקים בפרוטוקול זה מספיק כדי לשמור על OD600 בטווח הליניארי עבור 2-16 תולעים לכל באר למשך ~72 שעות. בהתאם לסם המעניין, באר המכילה יותר מ -16 תולעים עלולה לרוקן את ריכוז החיידקים לפני המדידה השנייה. מצאנו גם שבארות עם חיה אחת נוטות להיות לא אמינות. גורם הליזיס עולה על מה שתולעת בודדת אוכלת. לפיכך, טעויות קלות בקביעת גורם הליזיס משפיעות באופן לא פרופורציונלי על בארות עם פחות תולעים.

אנו ממליצים להחריג בארות מניתוחים סטטיסטיים אם אחד התנאים להלן מתקיים. יש זכרים בבאר (אין לנו נתונים המשווים את צריכת המזון בין זכרים להרמפרודיטים); יש פחות מ 2 תולעים בבאר או יותר מ 16 תולעים בבאר; תולעים מתות בקריאה השנייה; או אם יש צאצאים בבארות כי ה-FUdR נכשל. FUdR רגיש לחום ומנוטרל אפילו בטמפרטורות נמוכות עד 37 מעלות צלזיוס. יש להפשיר תמיד את FUdR במים בטמפרטורת החדר.

ערכי צריכת מזון שליליים:

ערכי צריכת המזון הם לעתים שליליים, מה שמרמז על יותר מזון ביום 4 מאשר ביום 1. ערכי צריכת מזון שליליים עשויים להצביע על אחד הגורמים הבאים: שיעור גבוה של ליליזה עצמית , שנגרם אולי על ידי תרופה שנוספה הפועלת על החיידקים, או ערכי צריכת מזון שליליים, אשר עשויים להצביע על כך שהבאר מזוהמת ומשהו אחר מלבד תולעים גדל. שיעורי הליזה העצמית גדלים גם הם ככל שהחיידקים מזדקנים; לכן, אנו ממליצים להשתמש בחיידקים בני לא יותר משבוע. נוספה תרופה שמזרזת עם הזמן, המשפיעה על ערך OD600 . רעידות לא מספיקות ביום הראשון עלולות להוביל לקריאה נמוכה יותר של OD600 עקב גושי חיידקים. התולעים עברו לחץ היפוקסי. זה קורה כאשר יחס פני השטח לאוויר אינו מספיק כדי לאפשר חילופי חמצן. השתמש בצלחת הספציפית של 96 בארות בחומרים ואל תעלה על 150 μL (120 μL + 30 μL של FUdR) לכל באר. המרחק בין פני השטח של הבאר לבין התחתית שבה התולעים חיות קובע את ריכוז החמצן.

מגבלות:

בדיקה זו מוגבלת לתרבית נוזלית. התנהגויות האכלה שנצפו בצלחות מוצקות, כגון תנועה על מדשאות מזון ומחוצה להן, אינן ניתנות להערכה באמצעות הבדיקה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו רוצים להודות ל- Xiaolan Ye, שכן פרוטוקול זה פותח כתוצאה מתצפית שהיא עשתה במקור. אנו מודים לכל חברי מעבדת Petrascheck בעבר ובהווה על עזרתם בפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי R21 AG080376 (ל- M.P). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440).

Materials

Amphotericin B RPI A40030-0.1 solvent: EtOH
Ampicillin Fisher Scientific BP176025 solvent: water
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 use to make NGM plates
Carbenicillin Fisher Scientific 46-100-RG solvent: water
Cell strainer Fisher Scientific 22363547 40 µm to remove adults
Cholesterol  MP Biomedicals 02101380-CF 5 mg/mL stock
Difco, Agar, Bacteriological BD Biosciences 214510 use to make NGM plates
Fluorodeoxyuridine Sigma Aldrich F0503 to sterilize worms on L4
Luria Broth RPI L24045-1000.0 open capsule, mix with 1 L of water, autoclave
M9 Buffer  Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358)
3 g KH2PO4 (FW: 136)
 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246)
 autoclave
Microplate Sealer Fisher Scientific 236707
OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Plate 96-well  Falcon 351172
Plate reader Tecan 30016056 use 600 nm filter lens
Potassium Citrate, 1 M , pH 6 Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324)
26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210)
900 mL of dH2O
pH to 6 using 5 M KOH
autoclave 
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6  Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
136 g KH2PO4 (FW: 136)
900 mL dH2O
 pH to 6 using 5 M KOH
autoclave
S-Basal Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
5.9 g NaCl (FW: 58)
 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6)
add 900 mL dH2O
autoclave, cool to 55 °C
S-Complete Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT)
 10 mL of 1 M potassium citrate
 pH 6, 10 mL of trace metal solutions
 3 mL of 1 M CaCl2
3 mL of 1 M MgSO4
Serotonin hydrochloride Thermo Scientific AAB2126309 used at 5 mM
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653-5KG to make buffers and NGM plates
Terrific Broth Thermo Scientific J75856-A1 12.5 g in 250 mL of water, autoclave
Titer plate Shaker Thermo Scientific 88880023 shaken at 800 rpm, depends on shaker
Trace Metals Solution  Laboratory Prepared Store in sterile conditions at room temperature
To prepare 1 L:
1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24)
0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278)
 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198)
0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287)
 0.016 g CuSO4 (FW: 158)
autoclave
wrap in aluminum foil to keep in the dark

References

  1. Taormina, G., Mirisola, M. G. Calorie restriction in mammals and simple model organisms. Biomed Res Int. 2014, 308690 (2014).
  2. Cunningham, K. A., et al. Amp-activated kinase links serotonergic signaling to glutamate release for regulation of feeding behavior in C. elegans. Cell Metab. 16 (1), 113-121 (2012).
  3. You, Y. J., Kim, J., Raizen, D. M., Avery, L. Insulin, cgmp, and tgf-beta signals regulate food intake and quiescence in C. elegans: A model for satiety. Cell Metab. 7 (3), 249-257 (2008).
  4. Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (4), 1399-1406 (1995).
  5. Apfeld, J., Kenyon, C. Cell nonautonomy of C. elegans daf-2 function in the regulation of diapause and life span. Cell. 95 (2), 199-210 (1998).
  6. Srinivasan, S. Neuroendocrine control of lipid metabolism: Lessons from C. elegans. J Neurogenet. 34 (3-4), 482-488 (2020).
  7. Calculli, G., et al. Systemic regulation of mitochondria by germline proteostasis prevents protein aggregation in the soma of. elegans. Sci Adv. 7 (26), eabg3012 (2021).
  8. Avery, L. The genetics of feeding in Caenorhabditis elegans. Genetics. 133 (4), 897-917 (1993).
  9. Wu, Z., et al. Dietary restriction extends lifespan through metabolic regulation of innate immunity. Cell Metab. 29 (5), 1192-1205.e8 (2019).
  10. Chen, A. L., et al. Pharmacological convergence reveals a lipid pathway that regulates C. elegans lifespan. Nat Chem Biol. 15 (5), 453-462 (2019).
  11. Gomez-Amaro, R. L., et al. Measuring food intake and nutrient absorption in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 443-454 (2015).
  12. Mckay, J. P., Raizen, D. M., Gottschalk, A., Schafer, W. R., Avery, L. Eat-2 and eat-18 are required for nicotinic neurotransmission in the Caenorhabditis elegans pharynx. Genetics. 166 (1), 161-169 (2004).
  13. Hobson, R. J., et al. Ser-7, a Caenorhabditis elegans 5-ht7-like receptor, is essential for the 5-ht stimulation of pharyngeal pumping and egg laying. Genetics. 172 (1), 159-169 (2006).
  14. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  15. Webster, C. M., et al. Genome-wide rnai screen for fat regulatory genes in C. elegans identifies a proteostasis-ampk axis critical for starvation survival. Cell Rep. 20 (3), 627-640 (2017).
  16. Reis Rodrigues, P., et al. Synthetic ligands of cannabinoid receptors affect dauer formation in the nematode Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 6 (6), 1695-1705 (2016).
  17. Levichev, A., et al. The conserved endocannabinoid anandamide modulates olfactory sensitivity to induce hedonic feeding in C. elegans. Curr Biol. 33 (9), 1625-1639.e4 (2023).
  18. Wang, D., et al. Genetic behavioral screen identifies an orphan anti-opioid system. Science. 365 (6459), 1267-1273 (2019).
  19. Cheong, M. C., Artyukhin, A. B., You, Y. J., Avery, L. An opioid-like system regulating feeding behavior in C. elegans. Elife. 4, e06683 (2015).
  20. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  21. Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (21), 8084-8089 (2004).
  22. Witham, E., et al. C. elegans body cavity neurons are homeostatic sensors that integrate fluctuations in oxygen availability and internal nutrient reserves. Cell Rep. 14 (7), 1641-1654 (2016).
  23. Hussey, R., et al. Oxygen-sensing neurons reciprocally regulate peripheral lipid metabolism via neuropeptide signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (3), e1007305 (2018).
  24. Zapata, R. C., et al. Adipocytes control food intake and weight regain via vacuolar-type h(+) atpase. Nat Commun. 13 (1), 5092 (2022).
  25. Clay, K. J., Yang, Y., Clark, C., Petrascheck, M. Proteostasis is differentially modulated by inhibition of translation initiation or elongation. Elife. 12, e76465 (2023).
  26. Perez-Gomez, A., et al. A phenotypic caenorhabditis elegans screen identifies a selective suppressor of antipsychotic-induced hyperphagia. Nat Commun. 9 (1), 5272 (2018).
  27. Zapata, R. C., Zhang, D., Chaudry, B., Osborn, O. Self-administration of drugs in mouse models of feeding and obesity. J Vis Exp. (172), 62775 (2021).
  28. Zapata, R. C., et al. Targeting clic1 for the treatment of obesity: A novel therapeutic strategy to reduce food intake and body weight. Mol Metab. 76, 101794 (2023).
  29. Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Commun Biol. 3 (1), 653 (2020).
  30. Stuhr, N. L., Curran, S. P. Different methods of killing bacteria diets differentially influence Caenorhabditis elegans physiology. MicroPubl Biol. 2023, (2023).
  31. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
  32. Wofford, M. R., King, D. S., Harrell, T. K. Drug-induced metabolic syndrome. J Clin Hypertens (Greenwich). 8 (2), 114-119 (2006).

Play Video

Cite This Article
Clark, C., To, A., Petrascheck, M. Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance. J. Vis. Exp. (204), e66422, doi:10.3791/66422 (2024).

View Video