Summary

Портативный бумажный иммунологический анализ в сочетании с приложением для смартфона для колориметрического и количественного обнаружения антигена Dengue NS1

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Для удовлетворения неотложных потребностей в диагностике лихорадки денге мы представляем интегрированное в приложение для смартфона бумажное аналитическое устройство Dengue NS1 (DEN-NS1-PAD) для количественного определения концентрации антигена Dengue NS1 в клинических образцах сыворотки/крови. Эта инновация повышает эффективность лечения денге, помогая принимать клинические решения в различных медицинских учреждениях, даже в условиях ограниченных ресурсов.

Abstract

Инфекция, вызванная вирусом денге (DENV), которая передается комарами Aedes , является серьезной проблемой общественного здравоохранения в тропических и субтропических странах. С учетом того, что ежегодная заболеваемость составляет около 10 миллионов случаев заболевания и 20 000-25 000 случаев смерти, особенно среди детей, существует острая потребность в практических диагностических инструментах. Присутствие неструктурного белка денге 1 (NS1) во время ранней инфекции было связано с высвобождением цитокинов, сосудистой утечкой и эндотелиальной дисфункцией, что делает его потенциальным маркером тяжелой денге.

Бумажные иммунологические анализы, такие как анализы бокового потока (LFA) и микрофлюидные аналитические устройства на бумажной основе (PAD), завоевали популярность в качестве диагностических тестов благодаря своей простоте, быстроте, дешевизне, специфичности и легкости интерпретации. Тем не менее, традиционные бумажные иммунологические анализы для выявления денге NS1, как правило, основаны на визуальном осмотре, что дает только качественные результаты. Чтобы устранить это ограничение и повысить чувствительность, мы предложили портативный тест на обнаружение денге NS1 на бумажном аналитическом устройстве (PAD), а именно DEN-NS1-PAD, который интегрирует приложение для смартфона в качестве колориметрического и количественного считывателя. Система разработки позволяет проводить прямое количественное определение концентраций NS1 в клинических образцах.

Образцы сыворотки и крови, полученные от пациентов, были использованы для демонстрации работы прототипа системы. Результаты были получены немедленно и могут быть использованы для клинической оценки как в хорошо оборудованных медицинских учреждениях, так и в условиях ограниченных ресурсов. Эта инновационная комбинация бумажного иммунологического анализа с приложением для смартфона предлагает многообещающий подход к улучшенному выявлению и количественному определению антигена денге NS1. Повышая чувствительность, превышающую возможности невооруженного глаза, эта система обладает большим потенциалом для улучшения процесса принятия клинических решений при лечении денге, особенно в отдаленных или недостаточно обслуживаемых районах.

Introduction

Инфекция, вызванная вирусом денге (DENV), является самой быстро распространяющейсяболезнью, переносимой комарами1, и более 390 миллионов человек инфицированы 96 миллионами симптоматических инфекций, 2 миллионами случаев тяжелого течения болезни и более 25 000 смертей в годв мире 1,2. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), примерно 3,9 миллиарда человек подвержены риску заболевания денге; ~70% проживают в странах Азиатско-Тихоокеанского региона и в основном в Юго-Восточной Азии3. В 2019 г. число случаев денге, о которых было сообщено ВОЗ, составило 4,2 миллиона, и на Таиланд пришлось не менее 136 000 случаев заболевания денге и 144 случая смертиот инфекции денге4. Вспышка лихорадки денге в Таиланде происходит в сезон дождей, с апреля по декабрь, как в городских, так и в сельских районах, особенно в северо-восточной части.

Инфекции DENV имеют различные клинические проявления, начиная от субклинических симптомов, легкой лихорадки денге (ДФ) и заканчивая тяжелой геморрагической лихорадкой денге (ДГЧ). Основной характеристикой тяжелого состояния ДГФ является повышенная проницаемость сосудов с последующим шоком и органной дисфункцией1. Понимание молекулярного пути, который может вызвать сосудистую утечку, очень важно для разработки эффективных методов лечения денге. Неструктурный белок денге 1 (NS1) представляет собой секретируемый гликопротеин во время ранней вирусной инфекции 5,6 и функционирует как кофактор репликации вирусной РНК7. NS1 может вызывать высвобождение цитокинов и способствовать утечке из сосудов, связываясь с толл-подобным рецептором 4 (TLR4) и эндотелиальным гликокаликсом 8,9. Исследования in vitro показали, что NS1 взаимодействует с эндотелиальными клетками и индуцирует апоптоз. Это состояние может способствовать эндотелиальной дисфункции и сосудистой утечке10. Уровни антигена NS1, коррелирующие с уровнями сывороточного интерлейкина (ИЛ)-10, были значительно повышены у пациентов с тяжелым клиническим заболеванием11. Денге NS1 также вносит свой вклад в патогенез заболевания, индуцируя IL-10 и подавляя DENV-специфические Т-клеточные ответы12,13. Кроме того, белок денге NS1 ассоциировался с тяжелым клиническим заболеванием, а концентрация NS1 > 600 нг мл-1 в первые 3 дня болезни ассоциировалась с развитием DHF14.

Персистенция антигена денге NS1 у пациентов с ДГФ может быть использована в качестве маркера тяжелой денге6. Существует несколько методов обнаружения NS1 в клинических образцах, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и экспресс-тест15. Золотым стандартом измерения концентрации белков NS1 в клинических условиях является метод ИФА. Однако метод ИФА является дорогостоящим и требует квалифицированного персонала и лабораторного оборудования16. Таким образом, разработка технологии обнаружения и количественного определения белков NS1 в тесте на месте оказания медицинской помощи (POCT) все еще продолжается. В последнее десятилетие бумажные иммунологические анализы, такие как анализы бокового потока (LFA) и микрофлюидные аналитические устройства на бумажной основе (μPA), стали популярными в качестве диагностических тестов из-за их простоты, быстроты, дешевизны и специфичности 17,18,19. В бумажном иммуноанализе для генерации сигналов было использовано несколько меток, таких как наночастицы золота (AuNPs)20, магнитные наночастицы21,22, квантовые точки23 и флуоресцентные материалы24,25. AuNP являются наиболее распространенными этикетками, используемыми в бумажных иммунологических анализах, из-за их недорогой стоимости производства, простоты изготовления, стабильности и простоты считывания. В настоящее время анализы латерального потока (LFA) на денге NS1 широко используются в клинических условиях26,27. Тем не менее, обычное распознавание этикеток LFA обычно выполняется невооруженным глазом и дает только качественные результаты.

За последнее десятилетие во всем мире широко использовалось более 5 миллиардов смартфонов, и есть потенциал для разработки портативных систем обнаружения28,29. Смартфоны обладают многофункциональными возможностями, такими как встроенные физические датчики, многоядерные процессоры, цифровые камеры, USB-порты, аудиопорты, беспроводное и прикладное программное обеспечение, что делает их пригодными для использования в различных биосенсорных платформах30. Кроме того, беспроводные технологии позволяют быстро передавать данные и могут использоваться для мониторинга в режиме реального времени и на месте31. Mudanyali et al. объединили бумажный иммунологический анализ и смартфоны для разработки портативной, не требующей оборудования, быстрой, недорогой и удобной в использовании платформы POCT для малярии, туберкулеза иВИЧ-32. Ling et al. сообщили об анализе бокового потока в сочетании с камерой смартфона для количественного определения активности щелочной фосфатазы в молоке33. Hou et al. также разработали двухмодальную систему визуализации на основе смартфона для количественных сигналов от цвета или флуоресценции в анализе бокового потока34. Кроме того, использование смартфона в качестве колориметрического и количественного считывателя может улучшить чувствительность, в то время как невооруженный глаз не может уверенно сообщить о присутствии цели35.

Представляя собой прорыв в диагностике денге, DEN-NS1-PAD 36,37,38 (далее именуемый устройством) предлагает портативное и эффективное решение. Используя технологию микрофлюидной бумаги с восковой печатью, это устройство количественно определяет NS1 с высокой чувствительностью и специфичностью за счет обработки изображений. Чтобы еще больше повысить его полезность, мы разработали удобное приложение для смартфона для колориметрического и количественного считывания. Клиническая валидация с использованием образцов пациентов из тайских больниц подчеркивает его непосредственное влияние на оценку состояния пациента в режиме реального времени. Наша инновация знаменует собой важнейший прогресс в области оптимизированного ведения денге в местах оказания медицинской помощи, обещая произвести революцию в диагностике в условиях ограниченных ресурсов здравоохранения.

Protocol

Комитет по этике Институционального наблюдательного совета, Медицинский департамент Королевской армии Таиланда, больница Пхрамонгкутклао, Бангкок, Таиланд (IRBRTA 1218/2562), дал одобрение. При проведении этого исследования мы соблюдали все необходимые этические нормы. 1. И…

Representative Results

Выбор метода изготовления имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимых результатов анализа в устройствах для иммуноанализа на бумажной основе. В нашем исследовании мы изучили различные производственные процессы и материалы в контексте демонстрации бумажного иммуноанал?…

Discussion

Одним из важных параметров конструкции считывающей системы на базе смартфона является способность обеспечивать воспроизводимую обработку изображений образцов. В этом исследовании, для простоты и удобства, изображения были получены с трех разных марок смартфонов с камерами 12-13 МП без…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.P. выражает благодарность стипендиальному исследовательскому фонду Исламского университета Индонезии (UII). Авторы выражают благодарность г-ну Нутчанону Ниньяви за его ценный опыт и помощь на протяжении всей разработки мобильного приложения, а также за его вклад в рукопись. Кроме того, авторы высоко оценивают финансовую поддержку, предоставленную Таиландским фондом научных исследований и инноваций (TSRI), Фондом фундаментальных исследований: 2023 финансовый год (проект No 2023). FRB660073/0164) в рамках программы «Умное здравоохранение» Технологического университета короля Монгкута в Тхонбури.

Materials

Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) 
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein   the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA  the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid Merck 10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)   PAA Lab GmbH (Germany) K41-001 
Casein Merck 9005-46-3
Chromatography paper Grade 2  GE Healthcare 3002-911 
Clear laminate film 3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate Merck 7558-79-4
Double tape side Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody  MyBiosource (USA) MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)   Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody   Merck AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody  MyBiosource (USA) MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody  MyBiosource (USA) MBS834236
NS1 serotype 2 antigens MyBiosource (USA) MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t elution buffer
Plastic backing card 10×30 cm Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL) Sigma Aldrich P4832
Potassium Chloride Merck 104936
Potassium monophosphate Merck 104877
Sodium Chloride Merck 7647-14-5
Sodium tetraborate  Sigma Aldrich 1303-96-4
Sucrose Merck 57-50-1
Tween 20 Sigma Aldrich 9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader BioTek
Mobile phones Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner Epson Perfection V30
Oven Memmert
Wax printer  Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation Google Cloud
ImageJ National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software

References

  1. Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
  2. World Health Organization (WHO). . Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , 1-34 (2012).
  3. . WHO Dengue and severe dengue Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020)
  4. Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. . Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
  5. Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
  6. Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
  7. Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
  8. Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
  9. Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
  10. Lin, C. -. F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
  11. Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
  12. Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
  13. Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
  14. Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
  15. World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). . Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control — New edition. , (2009).
  16. Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
  17. Kim, S. -. W., Cho, I. -. H., Lim, G. -. S., Park, G. -. N., Paek, S. -. H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
  18. Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
  19. Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V. Immunochromatographic methods in food analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 55, 81-93 (2014).
  20. Hu, J., et al. Advances in paper-based point-of-care diagnostics. Biosensors and Bioelectronics. 54 (4), 585-597 (2014).
  21. Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
  22. Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
  23. Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
  24. He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
  25. Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
  26. Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
  27. Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
  28. Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
  29. Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D. Biosensing with cell phones. Trends in Biotechnology. 32 (7), 351-355 (2014).
  30. Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
  31. Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
  32. Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
  33. Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
  34. Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
  35. You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -. Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
  36. Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
  37. Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
  38. Prabowo, M. H., et al. Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. , (2019).
  39. Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
  40. Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
  41. Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
  42. Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
  43. Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
  44. Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
  45. Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
  46. Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
  47. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
  48. Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
  49. Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
  50. Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
  51. Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
  52. Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
  53. Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
  54. Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
  55. Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
  56. Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
  57. Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
  58. Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
  59. Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).

Play Video

Cite This Article
Prabowo, M. H., Chalermwatanachai, T., Surareungchai, W., Rijiravanich, P. Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen. J. Vis. Exp. (203), e66130, doi:10.3791/66130 (2024).

View Video