Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum
Summary
Dit protocol beschrijft de opstelling van een driedimensionaal (3D) ex vivo model van de interactie tussen kankercellen en omtentum. Het model biedt een platform voor het ophelderen van pro-tumormechanismen binnen de vetniche en voor het testen van nieuwe therapieën.
Abstract
Eierstokkanker is de dodelijkste gynaecologische maligniteit. Het omentum speelt een sleutelrol bij het bieden van een ondersteunende micro-omgeving voor uitgezaaide eierstokkankercellen, evenals immuunmodulerende signalen die tumortolerantie mogelijk maken. We hebben echter beperkte modellen die de interactie tussen eierstokkankercellen en vetrijke weefsels nauw nabootsen. Om meer inzicht te krijgen in de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee het omentum een pro-tumorale micro-omgeving biedt, hebben we een uniek 3D ex vivo-model ontwikkeld van de interactie tussen kankercellen en omentum. Met behulp van menselijk omentum zijn we in staat om eierstokkankercellen te kweken in deze vetrijke micro-omgeving en de factoren te volgen die verantwoordelijk zijn voor tumorgroei en immuunregulatie. Naast het bieden van een platform voor de studie van deze vetrijke tumormicro-omgeving, biedt het model een uitstekend platform voor de ontwikkeling en evaluatie van nieuwe therapeutische benaderingen om uitgezaaide kankercellen in deze niche aan te pakken. Het voorgestelde model is eenvoudig te genereren, goedkoop en toepasbaar op translationele onderzoeken.
Introduction
Eierstokkanker is wereldwijd de dodelijkste gynaecologische maligniteit1. Het levenslange risico om deze kanker te ontwikkelen is ongeveer 1 op 70, met de mediane leeftijd van diagnose op 63-jarige leeftijd2. Primaire ovariële maligniteiten worden histologisch geclassificeerd als epitheliaal of niet-epitheel. Epitheliale eierstokkankers (EOC) vertegenwoordigen meer dan 90% van de tumoren en het meest voorkomende subtype is hooggradig sereus carcinoom (HGSC), dat goed is voor ongeveer 70%-80% van de EOC’s. Momenteel zijn er geen effectieve screeningsmethoden om ziekten vroegtijdig op te sporen. De meeste patiënten worden dus in een vergevorderd stadium gediagnosticeerd (d.w.z. Fédération Internationale de Gynécologie et d’Obstétrique [FIGO] stadium III of IV) nadat de kanker zich door de peritoneale holte heeft verspreid2.
Standaard eerstelijnsbehandeling is cytoreductieve chirurgie om alle zichtbare macroscopische ziekten te verwijderen, gevolgd door adjuvante chemotherapie op basis van platina om eventuele resterende microscopische ziekte te vernietigen. Hoewel er de afgelopen twee decennia veel vooruitgang is geboekt in de behandeling van eierstokkanker, zal ongeveer 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte binnen 3 jaarna de behandeling terugvallen. Gezien de over het algemeen slechte prognose van deze patiënten, zijn lopende en toekomstige translationele onderzoeksinspanningen in EOC gericht op het identificeren van biomarkers voor vroege detectie, het voorkomen van metastase, het verbeteren van huidige therapieën om resistentie te omzeilen en het ontwikkelen van nieuwe gepersonaliseerde kankerbehandelingen.
Gegeneraliseerde metastase in de peritoneale holte en de bijbehorende chemoresistentie zijn twee van de belangrijkste beperkingen voor de verbetering van de behandeling van patiënten met eierstokkanker 4,5. Het omentum, een vette schortachtige structuur die vanuit de maag over de darmen naar beneden hangt, is een belangrijke plaats van uitzaaiingen van eierstokkanker 6,7. Naast zijn functie als fysieke barrière, is aangetoond dat het omentum regeneratieve en angiogene capaciteiten heeft en immuunactiviteiten bezit, die samen de vascularisatie bevorderen, wondgenezing versnellenen infectie beperken. Het bevat een hoge concentratie stamcellen die kunnen differentiëren in verschillende celtypen en kunnen helpen bij het herstellen van beschadigde weefsels. Het omentum kan ontstoken raken als reactie op letsel of infectie, wat de migratie van immuuncellen naar de plaats van verwonding activeert9. Deze immuuncellen geven groeifactoren en andere moleculen af die helpen om het herstel en de regeneratie van beschadigd weefsel te bevorderen. Immuuncellen, zoals macrofagen, lymfocyten en plasmacellen, gelokaliseerd in het omentum zijn structuren die bekend staan als “melkachtige vlekken”, die verantwoordelijk zijn voor het detecteren en aanvallen van ziekteverwekkers en het reguleren van peritoneale immuniteit. Van het omentum is ook aangetoond dat het een rol speelt bij het induceren van immuuntolerantie10, het vermogen van het immuunsysteem om zelfantigenen te tolereren en gezonde weefsels niet aan te vallen. Dezelfde immuungerelateerde activiteiten zijn echter ook betrokken bij pathologische reacties, zoals de groei van omentale tumoren, metastase en ontsnapping aan immuunsurveillance 9,11. Eerdere studies van ons laboratorium en anderen hebben een unieke en actieve rol van de vetmicro-omgeving aangetoond bij de remming van antitumorale immuunresponsen en bij het verwerven van chemoresistentie12,13,14. Helaas hebben we beperkte informatie over de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee het omentum een pro-tumorale micro-omgeving biedt.
Om de interacties tussen kankercellen en het omentum beter te begrijpen, werd een 3D-kweeksysteem ontwikkeld dat bestaat uit menselijke eierstokkankercellen en van patiënten afgeleide omentum-explantaten. Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een nieuw ex vivo model van peritoneale carcinomatose. Dit model bootst de natuurlijke progressie van tumorigenese van eierstokkanker na in dit vetrijke weefsel. Het voorgestelde model is eenvoudig te genereren, goedkoop en mogelijk toepasbaar op translationeel onderzoek in onderzoek naar eierstokkanker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van dit protocol werd een preklinisch model van peritoneale carcinomatose voor eierstokkanker ontwikkeld met behulp van een combinatie van basale in vitro en ex vivo technieken. Een progressieve tumorgroei werd waargenomen gedurende 50 dagen co-cultuur na het zaaien van omentum-monsters met mCherry+ OCSC1-F2 menselijke eierstokkankercellen. Deze methode is ontwikkeld en geoptimaliseerd in verschillende experimentele onderzoeken met verschillende omentum-monsters. Succesvolle tumorgroei hing a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie wordt gedeeltelijk gefinancierd door The Janet Burros Memorial Foundation. We danken de patiënten en de afdeling Gynaecologische Oncologie van het Karmanos Cancer Institute voor het verzamelen van omentummonsters. We erkennen ook de Biobank en Correlative Sciences Core van het Karmanos Cancer Institute voor de coördinatie van de werving van patiënten en de voorbereiding van pathologiepreparaten. De Biobank and Correlative Sciences Core wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH Center-subsidie P30 CA22453 aan het Karmanos Cancer Institute aan de Wayne State University.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle | BD | 329652 | |
| 10 mL Serological Pipets | CELLTREAT | 229010B | |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Fisherbrand | FB012924 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229411 | |
| 24 Well Cell Culture Plate | Costar | 3524 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning Cell Counter | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate | Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel | Integra-Miltex | 4410 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Revolve microscope | Echo |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update. Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).
- Ledermann, J. A., et al. Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).
- Morgan, R. J., et al. Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology. J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Di Nicola, V. Omentum a powerful biological source in regenerative surgery. Regen Ther. 11, 182-191 (2019).
- Meza-Perez, S., Randall, T. D. Immunological functions of the omentum. Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).
- Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum. J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).
- Lee, W., et al. Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum. J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).
- Cardenas, C., et al. Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells. Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).
- Wu, Q., et al. Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression. J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).
- Zhang, Z., Scherer, P. E. Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte – a cancer cell’s best friend. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).
- Alvero, A. B., et al. TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo. Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).
- Alvero, A. B., et al. Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model. Sci Rep. 7, 40989 (2017).
- Craveiro, V., et al. Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment. Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).
- Sumi, N. J., et al. Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence. J Vis Exp. (93), e51815 (2014).
- Agarwal, R., et al. Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).
- Kelly, M. G., et al. TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer. Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).
- Li, J., et al. CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential. Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).
- Tedja, R., et al. Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential. Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).
- Dauleh, S., et al. Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum. PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).
