여기에서 우리는 설치류를 위해 설계된 해마 의존 공간 학습 패러다임인 활성 장소 회피 테스트를 위한 프로토콜을 제시합니다. 주요 매개변수를 변경하면 처리 전후 또는 시간이 지남에 따라 동물을 다시 테스트할 수 있습니다.
설치류의 해마 의존 공간 학습은 다양한 방법을 사용하여 테스트되었습니다. 여기에는 MWM(Morris water maze), Y-maze 및 NOL(Novel Object Location) 작업이 포함됩니다. 최근에는 APA(Active Place Avoidance) 작업이 이러한 전통적인 접근 방식의 대안으로 개발되었습니다. APA 작업에서 마우스는 고정된 충격 영역을 피하기 위해 회전하는 경기장 주변에 배치된 공간 신호를 사용해야 합니다. 조정할 수 있는 여러 매개변수로 인해 APA 작업은 매우 다양한 접근 방식임이 입증되었습니다. 그것은 쥐의 동일한 집단을 위해 세로로 그리고 반복적으로 사용되기에 적합하다. 여기에서는 APA 작업을 성공적으로 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 공간 학습의 다양한 구성 요소를 검사하는 데 사용할 수 있는 대안적인 APA 접근 방식을 강조합니다. 데이터 수집 및 분석 프로세스에 대해 설명합니다. 테스트를 성공적으로 수행할 가능성을 높이기 위해 APA 작업 중 중요한 단계에 대해 설명합니다. APA 작업은 기존의 공간 탐색 테스트에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 노화된 마우스 또는 알츠하이머병과 같은 질병 표현형이 있는 마우스와 함께 사용하는 것이 적절합니다. 작업의 복잡성을 쉽게 변경할 수 있으므로 광범위한 마우스 변형을 테스트할 수 있습니다. 또한, APA 과제는 뇌졸중이나 외상성 뇌 손상과 같은 운동 또는 신경 기능에 영향을 미칠 수 있는 수술 또는 실험적 중재를 받은 동물을 테스트하는 데 적합합니다.
APA(Active Place Avoidance)는 설치류 1,2,3,4에서 해마 의존 공간 학습을 테스트하는 효과적인 도구입니다. APA 과제 동안, 동물은 회전하는 경기장에 놓여지며 시각 신호를 사용하여 방향을 잡고 혐오스러운 충격 구역5을 피해야 한다. 경기장의 회전은 마우스가 탐색을 위해 특이한 접근 방식을 사용할 수 없도록 하며, 이러한 신호는 충격 영역이 정지 상태로 유지되는 동안 플랫폼에서 회전하기 때문에 냄새 표시를 사용할 수 없습니다5. 경기장의 속도와 방향, 충격 구역 및 시각적 단서의 위치를 변경하면 마우스를 여러 번 다시 테스트할 수 있습니다 6,7,8. APA는 가장 널리 사용되는 공간 학습 테스트 중 하나인 MWM(Morris water maze)에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 중요한 것은, 생쥐는 수영을 싫어하고 MWM 작업이 극도로 스트레스가 많다는 것이다9. 또한, 늙은 쥐는 MWM 작업(10) 동안 떠다니는 것으로 보고되었으며, 이로 인해 많은 경우에 공간 학습 작업으로 적합하지 않습니다. 또한 MWM 작업에는 테스트 중에 마우스가 찾을 수 있는 숨겨진 수중 플랫폼이 필요합니다. 이로 인해 물이 불투명해야 하며, 이는 일반적으로 흰색 페인트를 첨가하여 달성됩니다. 행동 작업 중 동물을 추적하고 분석하려면 개체와 주변 환경 간의 충분한 대비가 필요하며, Swiss 또는 BALB/c와 같은 특정 마우스 균주는 MWM에서 테스트되지 않아야 합니다. APA 작업에서 이 문제는 그리드 아래에 검은색 플라스틱을 추가하여 우회됩니다.
다중 APA 패러다임은 공간 학습을 테스트하도록 설계되어 효과적인 행동 도구로서의 유용성을 입증했습니다. 예를 들어, 공간 학습의 습득, 유지 및 통합은 일반적으로 3-5일 6,7,11,12일 범위의 동물에 대한 일일 테스트로 수행됩니다. 기억력과 학습은 각 획득일마다 받은 충격의 수를 비교하여 정량화됩니다. 첫 진입까지의 시간과 충격 영역을 피하는 최대 시간도 과제 중 학습 능력의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있는 중요한 매개변수입니다. 또는 공간 작업 메모리는 단일 30분 APA 세션 2,13을 수행하여 테스트할 수 있으며, 여기서 공간 학습은 5분 빈에서 충격 수치와 같은 성능을 비교하여 세션 내 변화로 측정됩니다.
이 문서에서는 APA 작업에 대해 설명하고 이 공간 학습 테스트를 수행할 때 고려해야 하는 주요 기능을 강조합니다.
결론적으로, 능동적 장소 회피 테스트는 다양한 마우스 균주와 실험 조건에서 사용할 수 있는 효과적인 공간 학습 작업입니다. APA 과제는 MWM과 같은 다른 공간 학습 패러다임(spatial learning paradigm)14과 관련된 한계를 극복하는데, 이는 코르티솔 수치(cortisol levels)9로 측정된 생쥐에게 스트레스를 준다. MWM은 또한 작업10 중에 떠 있는 것으로 보고된 노화된 마우스에는 적합하지 않습니다. 반스 미로(Barnes maze) 및 새로운 물체 위치 테스트와 같은 다른 공간 학습 테스트는 스트레스가 적지만 동일한 마우스 코호트에서 반복 테스트를 수행할 수 있는 빈도에 제한이 있습니다. 따라서 APA 작업의 가장 큰 장점은 참신함을 유지하기 위해 여러 매개변수를 조정할 수 있으므로 여러 번 사용할 수 있다는 것입니다. 실제로, 우리는 해마 절제술의 효과와 운동8의 후속 효과를 조사하기 위해 동일한 생쥐 집단에서 APA 작업을 최대 5번까지 사용했습니다. 각 사례에서 경기장 회전, 충격 영역, 공간 큐를 포함한 매개변수는 테스트 간에 변경되었습니다. 이는 대조군 동물이 높은 횟수의 충격으로 시작하여 각 실험 기간마다 후속 실험일 동안 감소하는 것에서 알 수 있듯이 생쥐가 공간 탐색 단서를 사용하여 과제를 다시 학습하도록 하는 데 효과적이었다8. 일반적으로 5일간의 테스트 패러다임이 끝나면 마지막 날에 10회 이상의 충격을 받았거나 최대 회피 횟수가 60초 미만인 동물은 패러다임을 학습하지 않은 것으로 간주합니다.
APA 작업은 여러 차례의 공간 테스트를 허용하도록 설정을 쉽게 수정할 수 있는 기능 외에도 마우스가 충격 영역을 효과적으로 피하기 위해 공간 탐색을 사용해야 한다는 것을 보장합니다. 예를 들어, 동물은 외부 신호를 사용하여 정지 충격 구역을 찾고 진입을 피해야 한다5. 투기장이 회전함에 따라, 동물들은 탐색을 위해 특이한 접근법을 사용할 수 없으며, 냄새와 같은 외부 수용 단서를 사용할 수 없는데, 이는 이러한 단서들이 투기장과 함께 회전하는 동안 충격 영역과 공간 단서가 정지해 있기 때문이다5.
생쥐가 연구자와 APA 영역에 적절하게 적응하도록 하는 것도 중요합니다. 발 충격의 강도도 최적화해야 하는데, 너무 낮거나 너무 높은 충격 강도는 마우스의 학습 및 작업 수행 능력을 손상시킬 수 있기 때문이다5. 충격 강도는 일반적으로 0.5mA로 설정되며 0.7mA를 초과해서는 안 됩니다. 불안과 같은 행동이 증가한 동물의 경우 빛의 강도와 발 충격 강도를 모두 줄이는 것이 좋습니다. APA 작업 중 불안 증가는 과도한 점프, 경기장 내 통제되지 않은 달리기 또는 장기간의 동결로 나타날 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 0.5mA의 충격 강도를 사용했는데, 이는 이전에 BALB/c에 사용된 것과 동일한 강도로, 불안과 유사한 행동이 더 높은 것으로 알려져 있습니다15.
여기에서는 사용된 활성 장소 회피 장비를 제공한 회사에서 제공한 동물 추적 소프트웨어에 대해 설명합니다. 대체 비디오 추적 소프트웨어도 행동 수행을 분석하는 데 적합합니다. 이러한 프로그램은 또한 APA 작업 중 마우스 성능을 정확하게 측정하고 분석할 수 있습니다. 이러한 프로그램을 사용하면 APA 경기장 내에 여러 구역과 위치를 만들어 행동을 평가할 수 있습니다. APA의 아레나 설정은 하나의 삼각형 쇼크 존으로 구성되며, 입구 수, 처음 입장하는 시간, 쇼크 존에서 보낸 시간이 측정됩니다. 경기장 내에 추가 구역을 추가할 수도 있습니다. 예를 들어, 중앙 구역 또는 충격 구역 반대편에 구역을 추가하여 소요 시간과 해당 구역에서 이동한 거리를 측정할 수 있으며, 이는 혐오 구역을 피하기 위한 동물 전략입니다. 이 프로그램은 마우스의 질량 중심을 추적한 다음 육안 검사를 위해 참조 프레임 위에 저장되고 표시됩니다(그림 6A, B). 마지막으로, 개인 및 그룹 성과에 대한 밀도 히트맵을 생성할 수도 있습니다(그림 6C).
APA 작업을 수행할 때 해결해야 할 잠재적인 문제가 있습니다. 경우에 따라 마우스는 충격 영역에 대한 무반응으로 인해 분석에서 제외해야 합니다. 항상 그렇듯이 제외는 사전 정의된 이상치 조건(예: 평균에서 2 표준 편차를 벗어나는 경우)을 충족하는 경우에만 고려해야 합니다. APA와 같은 복잡한 행동 작업에는 일반적으로 동물의 높은 N 값이 필요합니다. APA를 수행하기 전에 적절한 표본 크기를 계산하기 위해 전력 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이것은 사용된 균주와 치료 그룹에 따라 다릅니다. 경험에 따르면 각 그룹에 대해 n 값이 10 이상이면 APA 실험을 수행할 때 충분한 전력을 제공하는 것으로 나타났습니다. 이 작업의 주요 문제는 작업 중 마우스의 고품질 추적을 보장하는 것입니다. 작업의 습관화 단계를 사용하여 이러한 작업이 발생하고 있는지 확인해야 합니다. 쥐가 충격에 반응하지 않는 것은 종종 그리드 막대 사이의 스캣 때문입니다. 따라서 모든 동물을 동물이 죽은 후에는 채비를 청소하고 스캣이나 소변을 제거하는 것이 중요합니다. 이것은 또한 따라오는 동물들의 스트레스를 줄일 것입니다. APA 과제는 일반적으로 5일 패러다임을 포함하며, 이는 5일 미만의 효과가 있는 중재와 관련된 연구에 대해 일부 제한 사항을 제시할 수 있습니다. 그러나 단기 기억 또는 공간 학습 습득은 여전히 30분, 단일 세션 접근 방식을 사용하여 이러한 연구에 대해 평가할 수 있습니다.
요약하면, 이 기사에서는 활성 장소 회피 패러다임을 설정하고 사용하여 마우스의 공간 학습을 테스트하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 다양한 색상의 여러 마우스 변형을 테스트할 수 있도록 조건을 변경할 수 있는 기능은 MWM과 같은 다른 전통적인 공간 테스트에 비해 뚜렷한 장점입니다. 또한, 여러 매개변수를 수정하면 반복적인 테스트가 가능하므로 다양한 실험 패러다임 동안 또는 생리학적 노화 중에 공간 학습의 변화를 정확하게 비교할 수 있습니다. 단기간에 APA 테스트는 해마 의존 공간 학습을 위한 정확하고 효과적인 대안으로 입증되었습니다. 앞으로 APA 과제는 야생형 마우스와 형질전환 마우스 모두에서 인지 및 공간 행동에 대한 치료 또는 운동 중재를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 사용될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 이 원고에 설명된 장치의 개발 및 유지 관리에 대해 Queensland Brain Institute(QBI) Animal Behaviour Facility에 감사드립니다.
Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
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Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |