Summary

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Published: October 13, 2023
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.

Abstract

A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por crises recorrentes, parcialmente correlacionadas com a origem genética, afetando mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo. Apesar da importância clínica da epilepsia, a análise funcional da atividade neural no sistema nervoso central ainda precisa ser desenvolvida. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com a expressão estável de indicadores de cálcio codificados geneticamente, como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais. Drosophila melanogaster tem emergido como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à epilepsia devido à sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais. Neste estudo, apresentamos um protocolo novo e eficiente para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta com GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. Todo o cérebro é preparado a partir de cac, um gene bem conhecido da epilepsia, moscas knockdown para imagens de cálcio com um microscópio confocal para identificar a atividade neural como um acompanhamento do ensaio de comportamento semelhante a uma convulsão sensível ao bang. As moscas knockdown mostraram uma taxa mais alta de comportamento semelhante a convulsões e atividades anormais de cálcio, incluindo mais picos grandes e menos pequenos picos do que moscas selvagens. As atividades de cálcio foram correlacionadas com o comportamento semelhante a uma crise. Esta metodologia serve como uma metodologia eficiente na triagem de genes patogênicos para epilepsia e na exploração do mecanismo potencial da epilepsia em nível celular.

Introduction

A epilepsia, uma complexa desordem neurológica crônica caracterizada pela recorrência de crises espontâneas e não provocadas e atividade aberrante da rede neuronal, tem afetado mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo, tornando-se uma das doenças neurológicas mais comuns1 e levando à sobrecarga das famílias e da sociedade. Em consideração ao impacto da epilepsia, muitos estudos têm sido realizados para identificar a etiologia das crises, cuja genética tem sido aprovada como causa primária de muitos tipos de epilepsias ou síndromes epilépticas2. Nas últimas décadas, os avanços nas tecnologias genômicas levaram a um rápido aumento na descoberta de novos genes associados à epilepsia, que desempenham um papel crucial na ocorrência de crises, incluindo canais iônicos e genes de canais não iônicos 3,4. No entanto, os mecanismos subjacentes e a análise funcional entre os genes e fenótipos epilépticos são incompletamente compreendidos. A identificação de genes e mecanismos associados à epilepsia oferece a possibilidade de um manejo eficiente dos pacientes 5,6.

Sinais citosólicos de cálcio são elementos fundamentais na atividade neuronal e transmissão sináptica. A imagem do cálcio, incluindo os cortes cerebrais7, in vivo8,9 ee x vivo10, tem sido utilizada para monitorar a atividade neuronal11 como marcador de excitabilidade neuronal desde a década de 197012,13. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com os indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs), como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais 14,15,16, que apresenta um alto nível de precisão espaço-temporal. Alterações na concentração de cálcio e transientes foram observados nos potenciais de ação e transmissão sináptica, respectivamente14, indicando que a alteração dos níveis intracelulares de cálcio apresenta estreita correlação com a excitabilidade elétrica dos neurônios17,18. A cintilografia com cálcio também tem sido aplicada como modelo de crise do desenvolvimento9 e realizada em Drosophila para triagem de compostos anticonvulsivantes19.

Drosophila melanogaster vem emergindo como um poderoso organismo modelo em pesquisas científicas, como a epilepsia, por sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais20,21,22. Além disso, as ferramentas genéticas avançadas em Drosophila têm contribuído para a expressão do indicador de cálcio codificado geneticamente GCaMP6. Por exemplo, os sistemas transcricionais binários baseados em Gal4 e UAS permitem a expressão específica do GCaMP6 de forma controlada espacial e temporalmente. Como a Drosophila é um organismo minúsculo, a imagem do cálcio in vivo requer habilidades operacionais proficientes para realizar uma intervenção cirúrgica, na qual apenas uma pequena parte do dorso do cérebro foi exposta através de uma pequena janela14,23. Ao mesmo tempo, imagens de cálcio ex vivo no cérebro intacto de Drosophila podem ser usadas para monitorar as regiões de interesse (ROIs) de todo o cérebro.

Neste estudo, apresentamos imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. CACNA1A é um gene bem conhecido da epilepsia, o cac pertence ao canal Cav2, que é um homólogo ao CACNA1A. Começamos dissecando os cérebros de moscas knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi e imageando-os usando um microscópio confocal com modo de varredura xyt. Em seguida, analisamos as mudanças nos sinais de cálcio das ROIs por meio do cálculo de indicadores que quantificam eventos espontâneos semelhantes a crises, como o valor de %ΔF/F e eventos de cálcio da fluorescência GCaMP6. Adicionalmente, realizamos estímulos mecânicos por máquina de vórtice para induzir testes de comportamento convulsivo em moscas cac-knockdown, bem como para validar os resultados da imagem de cálcio. Em geral, este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos Drosophila através de imagens de cálcio ex vivo, permitindo a exploração dos mecanismos potenciais da epilepsia em nível celular.

Protocol

1. Protocolo para ensaio bang-sensitive Estabelecer as moscas experimentais cruzando a linha condutora tub-Gal4 com a linha UAS-cac-RNAi através do sistema Gal4/UAS21. Coletar as moscas virgens da linhagem tub-Gal4 e as moscas machos da linhagem UAS-cac-RNAi . Em seguida, transfira as moscas virgens e machos para o mesmo frasco para colher a prole.NOTA: A linha de driver tub-Gal4 permitirá alcançar o knockdown global do…

Representative Results

Usando este protocolo, descobrimos que as moscas knockdown cac mostraram taxas significativamente mais altas de comportamento semelhante a convulsões do que as moscas WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; Teste t de Student, Figura 1A). A maioria das moscas tub-Gal4>UAS-cac-RNAi se recuperou dentro de 1-5 s, enquanto UAS-cac-RNAi se recuperou dentro de 2 s. A porcentagem de recuperação de moscas knockdown de <e…

Discussion

O íon cálcio serve como um segundo mensageiro crucial, desempenhando um papel fundamental em uma série de respostas fisiológicas e fisiopatológicas a perturbações químicas e elétricas. Além disso, o elemento topológico dos canais P/Q pré-sinápticos, codificado pelo gene CACNA1A humano, tem sido identificado como responsável pela descarga de vários neurotransmissores, incluindo o glutamato 30,31,32, e está intimamente ligado à epilepsia<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Investigação Básica e Básica Aplicada de Guangdong (bolsa n.º 2022A1515111123 a Jing-Da Qiao) e pretende melhorar a investigação científica em GMU (Jing-Da Qiao). Este trabalho também foi apoiado pelo Plano de Capacitação de Inovação de Estudantes da Universidade de Medicina de Guangzhou (Financiamento No. 02-408-2304-02038XM).

Materials

Brushes Panera AAhc022-2 for handling flies
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C4901
Confocal microscope SP8; Zeiss, Jena, Germany. N/A for calcium imaging
CO2 anesthesia machine N/A N/A for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder N/A N/A handmade, for mounting the brain
Culture vials Biologix 51-0500 2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA version: 2.14.0 for analysis
Fly morgue N/A N/A handmade, for handling flies
Fly stocks cac-RNAi 27244 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks GCaMP6m 42750 from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks tub-Gal4 N/A from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose Sigma-Aldrich G8270
High-resolution camera N/A N/A for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine Sigma-Aldrich L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028
Papain suspension Worthington Biochemical LS003126
Petri dishes Sigma-Aldrich SLW1480/02D for dissection
Pipette Thermo Scientific 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Recording dish Thermo Scientific 150682- Glass Based Dish for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S8282
Stereo-binocular microscope SHANG GUANG XTZ-D for handling flies and dissection
Syringe needles pythonbio HCL0693 for dissection
Tripod WEIFENG 45634732523 for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich Z653438 for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard N/A N/A handmade, foam pad or paper for background

References

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He, M., Liu, C., Zhang, X., Lin, Y., Mao, Y., Qiao, J. Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy. J. Vis. Exp. (200), e65825, doi:10.3791/65825 (2023).

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