실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증의 동물 모델 역할을 합니다. 이 기사에서는 EAE에서 척수 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 채점하는 접근 방식을 설명합니다. 또한, 생쥐 혈청에서 용해성 신경 필라멘트 광 수준을 정량화하는 방법이 제시되어 살아있는 생쥐의 축삭 손상 평가를 용이하게 합니다.
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 일반적인 면역 기반 모델입니다. 이 질병은 미엘린 수초의 단백질 성분과 완전한 프로인트 보조제(CFA)를 사용한 적극적인 면역에 의해 또는 미엘린 단백질/CFA를 프라이밍한 설치류에서 미엘린 특이적 T 효과기 세포를 순진한 설치류로 전달하여 설치류에서 유발될 수 있습니다. EAE의 중증도는 일반적으로 상행 마비의 정도를 측정하는 5점 임상 척도로 점수가 매겨지지만 이 척도는 EAE에서 회복 정도를 평가하는 데 최적이 아닙니다. 예를 들어, 일부 EAE 모델(예: EAE의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질[MOG] 펩타이드 유도 모델)에서 임상 점수는 높은 수준을 유지합니다. 따라서 중추 신경계(CNS)에서 세포 손상의 기본 메커니즘을 연구하는 수단을 제공하는 EAE의 조직학적 점수로 임상 점수를 보완하는 것이 중요합니다.
여기에서는 생쥐의 척수 및 뇌 절편을 준비하고 염색하고 척수의 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 점수화하기 위한 간단한 프로토콜이 제시됩니다. 척수에서 백혈구 침윤을 채점하는 방법은 EAE에서 뇌 염증을 채점하는 데에도 적용될 수 있습니다. SIMOA(Small Molecule Assay) 분석을 사용하여 마우스의 혈청에서 용해성 신경필라멘트 광(sNF-L)을 측정하기 위한 프로토콜도 설명되며, 이는 살아있는 마우스의 전체 CNS 손상 정도에 대한 피드백을 제공합니다.
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 인간 탈수초성 질환인 다발성 경화증(MS)1에 대한 가장 흔한 쥐 모델입니다. IFN-γ(감마) 및 IL-17 생성 T도우미 세포2의 침윤, 염증성 단핵구의 침윤3, 혈관 주위 및 수막하 염증성 탈수초성 병변4의형성, 중추신경계(CNS)의 축삭 손상4 발생을 포함한 전형적인 다발성경화증 염증 병리학도 EAE 5,6,7,8,9에서 관찰된다. EAE와 다발성경화증 사이 면역 기계장치에 있는 유사성은 EAE를 나탈리주맙, fingolimod, 디메틸 fumarate 및 glatiramer 아세테이트를 포함하여 다발성 경화증을 위한 다수 승인되는 면역 근거한 치료의 효험 그리고 작용의 기계장치 시험을 위한 적당한 전임상 모형 만들었습니다 (1,5에서 검토됨). 특정 EAE 식이요법은 뇌의 수막하 염증, 만성 탈수초화, 척수 위축, 시냅스 및 뉴런 손실의 발달을 포함하여 축삭 손상을 넘어 진행성 다발성경화증 병리학의 다른 측면을 모델링합니다 6,10,11,12. 따라서 EAE는 다발성경화증에 대한 신경 보호 요법의 효능을 선별하는 데 유용합니다.
EAE는 여러 가지 방법으로 설치류에서 유도됩니다. 능동 면역은 가장 일반적인 유도 방법이며, 열사멸 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)이 보충된 CFA에서 유화된 미엘린 항원(전체 단백질 또는 펩타이드)으로 설치류를 면역화하는 것을 포함한다 13. 마우스의 균주에 따라 백일해 독소(PTX)도 면역 0일차와 2일차에 투여하여 질병의 침투율을 높인다13. EAE는 또한 미엘린/CFA-프라임 마우스로부터 수득한 미엘린-특이적 T 세포를 건강한 마우스로 입양하여 전달함으로써 유도될 수 있거나, 14 또는 주요 미엘린 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 과발현하는 마우스에서 자발적으로 발생할 수 있다5.
EAE 질병의 중증도 및 진행은 일반적으로 1 – 꼬리 절뚝거림, 2 – 뒷다리 또는 발 약화, 3 – 한쪽 또는 양쪽 뒷다리의 완전 마비, 4 – 앞다리 약화, 5 – 사망 또는 사망13. 이 임상 점수 시스템은 질병 발병 시 발생하는 상행 마비의 진행을 문서화하는 데는 건전하지만 중추신경계 염증 발작으로부터의 회복 정도를 포착하는 데는 덜 민감합니다. 예를 들어, 어렵게 보행하는 생쥐와 쉽게 보행하지만 발을 잡는 데 약점을 보이는 생쥐 모두 EAE 척도에서 2점이 할당됩니다. 염증 반응이 해결되었음에도 불구하고 영구적인 축삭 손상 또는 손실이 있기 때문에 EAE의 급성 후 단계에서 점수가 높게 유지될 수 있다9. EAE 9,16,17,18에서 임상적 결함의 차이를 더 잘 포착하기 위해 보다 정교한 채점 시스템, 행동 테스트, 뒷다리 및 악력 측정, 적외선 모니터링 시스템을 개발하기 위한 다양한 시도가 있었습니다. 그러나 이러한 더 복잡한 점수 측정은 근본적인 신경학적 결손에 대한 염증 대 조직 손상의 기여도를 구별하지 못합니다. 따라서 EAE의 중증도를 점수화하는 황금 표준 접근 방식은 임상 및 조직학적 점수를 모두 수행하는 것입니다.
여기에서는 EAE에서 발생하는 병변 형성의 확률적 과정을 포착하는 방식으로 생쥐 척수 및 뇌 표본을 파라핀에 해부하고 삽입하는 방법에 대한 프로토콜을 설명합니다. 또한 중추신경계에서 미엘린을 검출하는 Kluver와 Barrera19가 처음 만든 Luxol fast blue(LFB)로 절편을 염색하는 방법에 대한 프로토콜도 제시됩니다. 절편은 LFB만으로 염색하거나(탈수초화 분석용) 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 역염색하여 염증성 병변을 시각화하고 점수를 매기는 데 도움이 됩니다. 또한 상업적으로 이용 가능한 항체, 면역조직화학(IHC) 기술 및 공개적으로 액세스할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 척수에서 총 백혈구(CD45)의 존재, 미엘린 손실 및 손상된 축삭(SMI-32)의 수를 정량화하기 위한 프로토콜도 제공됩니다. 척수의 백혈구를 정량화하는 데 사용되는 프로토콜은 뇌의 백혈구를 정량화하는 데에도 적용할 수 있습니다.
뇌의 축삭돌기 손실과 손상에 대한 조직학적 평가는 뇌 백질관이 서로 평행하게 흐르지 않기 때문에 척수보다 상대적으로 어렵습니다. 혈청 신경 필라멘트 빛(sNF-L)의 측정은 MS20,21에서 신경 손상에 대한 유망한 바이오마커로 부상했습니다. 최근 연구에서는 이 기술을 EAE 22,23,24로 확장했습니다. 여기에서는 SIMOA(Small Molecule Assay) 분석을 사용하여 살아있는 마우스에서 혈청 신경필라멘트 광(sNF-L)을 측정하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 소량의 혈청만 필요하며 살아있는 쥐에서 단 반나절 만에 수행할 수 있어 테스트된 치료법이 전체 CNS 손상에 어떤 영향을 미치는지에 대한 신속한 피드백을 제공합니다. 여기에 설명된 모든 방법은 모든 성별 또는 균주의 마우스에 적용할 수 있습니다.
척수의 조직학적 염색은 EAE 질병의 중증도를 평가하는 데 중요한 도구이며, 특히 질병의 급성기 후 단계에서 질병 회복 정도에 치료 그룹 간에 차이가 있는 경우에 유용합니다. 면역 세포 침윤(CD45), 미엘린(LFB) 및 축삭 손상(SMI-32)에 대한 염색은 마우스에서 변경된 임상 점수의 근본적인 원인을 특성화하는 데 도움이 됩니다. 여기에 설명된 조직학적 염색 프로토콜은 염증의 관점과 미엘린 및 축삭 손상의 정도를 제공합니다. 또한, 표시된 결과는 EAE의 전체 신경 손상 정도를 평가하는 방법으로 sNF-L 측정을 검증합니다.
이 분석의 중요한 매개변수는 조사관이 절편의 정체를 눈멀게 하고 서로 다른 마우스에 걸쳐 척수의 각 수준에서 동일한 샘플링이 있는지 확인하는 것입니다. 이는 탯줄의 낮은 수준에서 염증의 심각성이 더 클 수 있기 때문입니다. 또 다른 중요한 매개변수는 실험 그룹의 크기입니다. 척수와 뇌는 일반적으로 종점에서 그룹당 6-8마리의 마우스에서 수집하여 치료 또는 유전자형이 적당한 효과 크기를 가진 그룹 간에 상당한 차이를 확인합니다. 또한 선택된 마우스의 평균을 구할 때 전체 그룹의 대표 평균 점수를 갖도록 하는 것도 중요합니다. 문제 해결과 관련하여 프로토콜에 익숙하지 않은 사람들이 직면하는 일반적인 문제는 척수가 불충분한 시간 동안 고정되어 있고 척추에서 쉽게 압출되지 않는다는 것입니다. 이 경우 가는 가위를 사용하여 가시 돌기를 따라 자르고 기둥을 열어 척수를 드러내는 방식으로 척수를 수동으로 절개할 수 있습니다. 또는 항체 염색의 성공을 방해하지 않고 며칠 동안 조직을 고정할 수 있습니다. 여기에 기술된 항체 클론은 포르말린에서 최대 2주까지 고정된 조직에서 작용합니다.
척수 조각을 삽입하려면 기술과 연습이 필요합니다. 아이 루프를 착용하고 램프를 임베딩 스테이션 위로 향하게 하여 단면이 단면으로 떨어지는지 세로 단면으로 떨어지는지 더 잘 시각화하는 것이 좋습니다. 그로스잉 시 척수 조각의 길이를 2mm 미만으로 유지하면 단면이 떨어지는 데 도움이 됩니다. 경험이 부족한 사용자에게 발생하는 또 다른 일반적인 문제는 하룻밤 배양 중에 LFB가 증발하여 슬라이드의 절반은 얼룩지고 절반은 염색되지 않은 상태로 남는다는 것입니다. 증발을 방지하려면 유리 염색 접시를 열가소성 필름으로 밀봉한 다음 플라스틱 랩으로 밀봉해야 합니다. 증발이 발생하고 단면이 고르지 않게 염색되면 탄산리튬으로 슬라이드를 완전히 탈청색하고 밤새 LFB에서 다시 염색하는 것이 좋습니다. 또 다른 일반적인 문제는 사용자가 LFB 후 회백질을 완전히 탈청색하지 않는다는 것입니다. 프로토콜의 다른 단계를 진행하기 전에 현미경으로 개별 섹션을 검사하여 충분한 양의 청색 제거에 도달했는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 CD45 및 SMI-32 IHC 염색은 강력한 성능을 보이지만 새로운 항체 로트를 받을 때마다 예비 실험에서 항체 농도를 문제 해결하는 것이 여전히 중요합니다. 이는 양성 대조군(EAE 척수)에서 다양한 농도의 항체를 검사하여 수행할 수 있습니다. 1차 염색에는 1차 항체를 첨가하지 않고 2차 항체만 사용하는 음성 대조군도 포함되어야 합니다. 마지막으로, 슬라이드나 섹션에서 얼룩이 고르지 않을 수 있으므로 이미지 분석에서 개별 이미지를 임계값으로 설정하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜은 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용합니다. 프로세서, 임베더 또는 마이크로톰에 액세스할 수 없는 경우 이러한 단계를 이러한 서비스를 제공하는 병원 기반 병리학 코어에 제공할 수 있습니다. 또한 슬라이드 스캐너를 사용할 수 없는 경우 비디오 카메라가 장착된 광학 현미경을 사용하여 척수 또는 뇌 영역의 TIFF 이미지를 저장할 수 있습니다. 현미경 기반 워크플로우의 경우 LFB 또는 LFB/H&E 절편을 저배율(40x 배율)로 캡처하고 CD45 및 SMI-32 염색의 경우 척수의 복부, 등쪽 및 측면 부분의 중앙에 있는 최소 4개의 창을 이미징합니다(CD45의 경우 200배 확대, SMI-32의 경우 400배 확대). 이러한 이미지에 대해 이미지 분석을 수행하여 설명된 것과 유사한 방식으로 염색을 정량화할 수 있습니다.
EAE를 점수화하기 위해 어떤 조직학적 접근 방식을 취해야 하는지에 대한 결정은 임상 점수가 그룹 간에 얼마나 다른지에 따라 달라집니다. 예를 들어, EAE 임상 점수에 급격한 차이가 있는 경우(한 그룹은 EAE를 얻었고 다른 그룹은 그렇지 않음), 이는 일반적으로 말초 매개 염증의 차이와 관련이 있습니다. 이 경우 LFB/H&E 염색 절편에 탈수초성 병변의 존재에 대한 점수는 충분하며 그룹 간의 차이를 드러낼 것입니다. 발병 시 임상 점수가 더 유사하고 임상적 회복 정도에 차이가 있는 경우(예: 그림 5A의 실험), 뇌간과 소뇌의 뇌 염증 점수를 포함하여 여기에 설명된 전체 조직학적 워크플로우를 적용하여 질병 만성의 차이가 염증 또는 조직 손상의 차이와 관련이 있는지 여부를 구별하는 것이 가장 좋습니다. CD45 계수로 평가한 바와 같이 염증의 차이가 발견되면 T 세포(항-CD3), 침윤성 단핵구/대식세포(Mac3) 및 미세아교세포(Iba-1/TMEM119)에 대한 염색을 위해 추가 IHC 연구를 수행할 수 있습니다(권장 항체 클론은 보충 표 3 참조). 미세아교세포 활성화는 이중 표지된 Iba-1+TMEM-19+ 미세아교세포에 대한 Iba-1 염색 강도의 증가와 섹션32에 대한 Sholl 분석으로 평가할 수 있는 미세아교세포 과정의 수축 증가에 의해 반영됩니다. 또한 유세포 분석 또는 단일 세포 RNA 염기서열 분석과 같은 기술을 적용하여 뇌와 척수에서 면역 집단의 빈도와 표현형을 보다 심층적으로 특성화할 수 있습니다.
SMI-32+ 축삭돌기의 계수는 EAE 32,33 및 MS34에서 축삭돌기 손상을 감지하는 민감한 방법입니다. SMI-32는 transected 뉴런의 end-bulbs에 축적된 neurofilament heavy 또는 medium의 non-phosphorylated 형태를 검출합니다. 손상된 축삭돌기를 검출하는 대안은 방해된 축삭 수송의 결과로 축삭에 축적될 수 있는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로 염색하는 것이다33. SMI-32 및 APP에 대한 염색 패턴은 둘 다 축삭 손상을 반영하지만, 일반적으로 겹치지 않으며, 이는 서로 다른 병리학을 검출하고 있음을 나타낸다33. 또한 척수와 뇌 모두에서 진행 중인 축삭 손상의 빠르고 민감한 측정인 sNF-L을 측정하여 축삭 손상의 조직학적 측정을 보완할 수 있습니다. 살아있는 쥐에서 반나절 만에 할 수 있다는 장점이 있습니다. 이 방법의 단점은 키트가 비싸고 기계가 고도로 전문화되어 있다는 것입니다. sNF-L 키트를 판매하는 회사는 SIMOA 기계에 액세스 할 수없는 사람들을 위해 서비스 요금을 제공합니다. 축삭 손상을 평가하는 대안은 척수12의 톨루이딘 청색 염색 부분에서 축삭을 계산하거나 척수 백질32 영역에서 SMI-31에 의해 검출된 신경 필라멘트 다발을 계산하여 축삭 손실에 대한 점수를 매기는 것입니다. 이 두 가지 모두 SMI-32 또는 sNF-L 측정보다 더 힘든 접근 방식입니다.
EAE 임상 점수가 그룹 간에 다르지만 염증, 탈수초화 및 축삭 손상에 대한 점수가 그룹 간의 차이를 나타내지 않는 경우 GFAP를 사용하여 성상세포 활성화를 위해 염색하는 것이 유용할 수 있습니다(권장 항체 클론에 대한 보충 표 3 참조). 성상세포(astrocyte) 활성화는 GFAP 염색의 증가와 연관되어 있으며, 이는 DA 랫트(35)의 만성 EAE를 포함한 일부 EAE 모델에서 EAE 진행과 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
결론적으로, 이 프로토콜은 방법을 설명하고 EAE의 조직학적 스코어링을 수행하기 위한 분석 워크플로우를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
Raymond Sobel 박사(Stanford University)가 뇌와 척수 절편을 고치는 방법을 알려주셔서 감사합니다. 토론토 현상유전체학 센터(Toronto Centre for Phenogenomics)의 카일 로버턴(Kyle Roberton)과 밀란 강굴리(Milan Ganguly)에게 임베딩 방법을 배우고 뇌와 척수 절편을 많이 잘라낸 것에 대해 감사를 표합니다. 척수의 뇌수막하 및 혈관 주위 염증을 평가하기 위한 프로토콜을 공유해 주신 Matthew Cussick 박사와 Robert Fujinami 박사(유타 대학교)에게 감사드립니다. CD45 항체 클론을 공유해 주신 Shalina Ousman에게 감사드립니다. St. Michael’s Hospital의 Keenan Research Centre of Biomedical Research에서 조직 처리기 및 조직 삽입 스테이션에 대한 교육을 제공하고 이 장비를 유지 관리해 주신 Xiofang Lu에게 감사드립니다. 이 연구는 MS Canada(SED)의 생물의학 보조금으로 지원되었습니다. 카르멘 우치페리(Carmen Ucciferri)는 캐나다 정부의 지원을 받고 있습니다. Nuria Alvarez-Sanchez는 Keenan의 박사후 연구원의 지원을 받고 있습니다.
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
Biosafety Cabinet | Any | ||
Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
ddH2O | – | – | |
Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
Fumehood | Any | ||
Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
Light microscope | Any | ||
Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
p1000 Pipette and Tips | various | ||
p200 Pipette and Tips | various | ||
Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408–129 | Used to store mouse serum samples |
Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |