Представлен метод изучения редиссеминации опухолевых клеток из метастазов в легкие, включающий хирургический протокол селективной фотоконверсии метастазов в легких с последующей идентификацией ресеминированных опухолевых клеток в третичных органах.
Метастазы – системное распространение рака – являются основной причиной смертей, связанных с раком. Хотя метастазирование обычно рассматривается как однонаправленный процесс, при котором клетки первичной опухоли распространяются и засеивают метастазы, опухолевые клетки в существующих метастазах также могут повторнораспространяться и давать начало новым поражениям в третичных участках в процессе, известном как «метастазирование из метастазов» или «посев метастазов из метастазов». Посев от метастаза к метастазу может увеличить метастатическую нагрузку и снизить качество жизни и выживаемость пациента. Таким образом, понимание процессов, лежащих в основе этого явления, имеет решающее значение для уточнения стратегий лечения пациентов с метастатическим раком.
Мало что известно о посеве от метастаза к метастазу, отчасти из-за логистических и технологических ограничений. Исследования посева от метастазов к метастазам основываются в основном на методах секвенирования, которые могут быть непрактичными для исследователей, изучающих точное время посева от метастазов к метастазам или то, что способствует или предотвращает их. Это подчеркивает отсутствие методологий, облегчающих изучение посева от метастазов к метастазам. Чтобы решить эту проблему, мы разработали и описываем здесь протокол хирургии мышей для селективной фотоконверсии метастазов в легких, позволяющий специфически маркировать и отслеживать судьбу опухолевых клеток, редиссемирующихся из легких в третичные участки. Насколько нам известно, это единственный метод изучения редиссеминации опухолевых клеток и посева метастазов из легких, не требующий геномного анализа.
Метастазы являются основной причиной смертности, связанной с раком1. Метастатический рак возникает, когда клетки первичной опухоли распространяются по всему организму и пролиферируют в клинически обнаруживаемые опухоли в отдаленных органах 2,3.
Хотя метастазирование обычно рассматривается как однонаправленныйпроцесс, при котором опухолевые клетки диссемируются из первичной опухоли и колонизируют отдаленные органы, все больше клинических и экспериментальных данных свидетельствуют о том, что имеет место более сложный, разнонаправленный процесс. Было показано, что циркулирующие опухолевые клетки могут повторно засеивать первичную опухоль (если она все еще находится на месте)5,6,7,8,9, а опухолевые клетки из существующих метастатических очагов могут перемещаться в третичные участки и давать начало новым поражениям 10,11,12,13. Действительно, данные недавних геномных анализов свидетельствуют о том, что некоторые метастатические поражения возникают не из первичной опухоли, а из других метастазов – явление, известное как «метастазирование из метастазов» или «посев метастазов в метастазы»14,15,16. Посев от метастаза к метастазу может увековечить патологический процесс даже после удаления первичной опухоли, увеличивая метастатическую нагрузку и снижая качество жизни и выживаемость пациентов. Таким образом, понимание процессов, лежащих в основе посева метастазов, имеет решающее значение для уточнения стратегий лечения пациентов с метастатическим заболеванием.
Несмотря на потенциально тяжелые клинические последствия, мало что известно о посеве от метастаза к метастазу, отчасти из-за логистических и технологических ограничений. Исследования на людях ограничены нехваткой клинических образцов. Клиническая резекция и биопсия метастатических поражений встречаются редко, как и биопсия, казалось бы, здоровых органов, где могут скрываться единичные диссеминированные опухолевые клетки. Это означает, что исследования на людях, как правило, возможны только с использованием образцов аутопсии людей, чьи первичные опухоли либо все еще существуют, либо были ранее удалены, но все еще доступны исследователям. При наличии таких образцов необходимо проводить анализ прогрессирования рака с использованием методов секвенирования14. Однако массовое секвенирование совместимых первичных опухолей и метастазов не обладает чувствительностью, необходимой для комплексного отслеживания родословной. Например, массовое секвенирование одного поражения может выявить субклон, который невозможно обнаружить ни в одном из соответствующих поражений. В этом случае невозможно было бы определить происхождение этого субклона. Он мог присутствовать в первичной опухоли или другом метастазе с частотой ниже предела обнаружения, или он мог возникнуть после первоначальной колонизации метастатического поражения, в котором он был обнаружен. Секвенирование отдельных клеток обеспечивает повышенную чувствительность, но его высокая стоимость ограничивает широкомасштабное применение этой методики. Ретроспективный характер этих исследований также означает, что они дают ограниченное представление о транзиторных метастатических событиях и картине заболевания в разные моменты времени.
В моделях животных последние технологические достижения теперь позволяют проводить перспективное филогенетическое картирование с высоким пространственным и временным разрешением 17,18,19,20. Эти методы используют редактирование генома CRISPR/Cas9 для создания клеток с эволюционирующим штрих-кодом – наследственными мутациями, которые накапливаются с течением времени. При секвенировании можно проследить родословную каждой клетки на основе мутационного профиля ее штрих-кода 17,18,19,20. Действительно, такая технология уже используется для картирования посева метастазов между метастазами. В недавней работе Zhang et al. продемонстрировали, что клетки рака молочной железы и предстательной железы при метастазах в кости редиссеминации из кости в семена вторичных метастазов во многих органах21.
Несмотря на то, что эти новые методы обладают большим потенциалом для создания подробных филогенетических карт прогрессирования рака с высоким разрешением, они крайне непрактичны для тех, кто изучает точное время появления метастазов и то, что способствует или предотвращает их. Восполнение этих пробелов в знаниях имеет решающее значение для уточнения нашего понимания и лечения метастатического рака, но существует заметная нехватка технологий, облегчающих такие исследования. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы недавно разработали и представляем здесь новую методику, которая позволяет нам специфически маркировать опухолевые клетки с помощью фотоконверсии в метастатическом участке (легком) и впоследствии повторно идентифицировать их в третичных органах. Используя этот метод, мы недавно показали, что клетки рака молочной железы действительно размножаются из метастазов в легких и засеивают третичные органы13. Этот метод также может быть использован для определения времени событий редиссеминации в узком окне и количественной оценки редиссеминированных опухолевых клеток, облегчая изучение органотропизма ресеминированных клеток и того, что способствует/предотвращает редиссеминации.
В то время как фотоконверсия и локально-индуцируемые системы cre/lox, которые постоянно заменяют один флуоресцентный белок другим, ранее использовались для маркировки и отслеживания опухолевых клеток 11,22,23, насколько нам известно, ни один подход к пространственно-временной маркировке опухолевых клеток не был оптимизирован для воздействия на легкие – одно из наиболее распространенных мест метастазирования среди мужчин и женщин с диагнозом любой из 14 наиболее распространенных видов рака.. Любой тип раковых клеток и любой протокол образования метастазов в легких могут быть использованы с нашей процедурой, что делает ее широко полезной для исследователей метастазов. Все раковые клетки, используемые для генерации метастазов в легких, должны экспрессировать фотоконвертируемый или фотопереключаемый белок, и исследователи могут выбирать, какой белок использовать, исходя из своих конкретных потребностей и ресурсов. В этом исследовании мы использовали клетки рака молочной железы 6DT1, которые стабильно экспрессировали фотоконвертируемый зелено-красный флуоресцентный белок Dendra2 (клетки 6DT1-Dendra2)25, помеченный гистоном H2B. Мы вводили 5,0 × 104 клеток 6DT1-Dendra2 в четвертую жировую подушку молочной железы самок мышей Rag2-/-. Первичные опухоли пальпировались между 12 и 16 днями после инъекции и не резецировались в течение всего эксперимента. Спонтанные метастазы в легких развивались между 19 и 26 днями после инъекции опухолевых клеток. Операции фотоконверсии проводились между 26 и 29 днями после инъекции опухолевых клеток. Мыши были принесены в жертву через 72 часа после операции из-за метастазирования в легких.
В данной работе мы описываем хирургический протокол селективной фотоконверсии опухолевых клеток в легком. Этот метод позволяет исследователям выборочно помечать опухолевые клетки в легких и отслеживать их судьбу, повторно идентифицируя их по всему телу в более поздний момент времен?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Уэйда Коба за помощь в микрокомпьютерной томографии (S10RR029545), Веру ДеМарэ и Хиллари Гузик из Центра аналитической визуализации за их обучение и помощь в микроскопии, Онкологический центр Монтефиоре им. Эйнштейна, Национальный институт рака (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Центр биофотоники им. Грусса Липпера, Программу комплексной визуализации для исследования рака, Стипендия сэра Генри Уэллкома (221647/Z/20/Z) и премия METAvivor за развитие карьеры.
0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |