Summary

Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay

Published: November 21, 2023
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Summary

Pseudotypisierte Viren (PVs) sind replikationsdefekte Virionen, die verwendet werden, um Wirt-Virus-Interaktionen unter sichereren Bedingungen zu untersuchen als mit authentischen Viren. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das zeigt, wie SARS-CoV-2-PVs verwendet werden können, um die neutralisierende Fähigkeit des Serums von Patienten nach einer COVID-19-Impfung zu testen.

Abstract

Pseudotypisierte Viren (PVs) sind molekulare Werkzeuge, die verwendet werden können, um Wirt-Virus-Interaktionen zu untersuchen und die neutralisierende Fähigkeit von Serumproben zu testen, zusätzlich zu ihrer bekannteren Verwendung in der Gentherapie für die Verabreichung eines Gens von Interesse. PVs sind replikationsfehlerhaft, weil das virale Genom in verschiedene Plasmide unterteilt ist, die nicht in die PVs eingebaut sind. Dieses sichere und vielseitige System ermöglicht den Einsatz von PVs in Laboren der Biosicherheitsstufe 2. Hier stellen wir eine allgemeine Methodik zur Herstellung von lentiviralen PVs vor, die auf drei Plasmiden basiert, wie hier erwähnt: (1) das Rückgratplasmid, das das Reportergen trägt, das zur Überwachung der Infektion benötigt wird; (2) das Verpackungsplasmid, das die Gene für alle Strukturproteine enthält, die zur Erzeugung der PVs benötigt werden; (3) Das Expressionsplasmid der Hülloberfläche, das den Virustropismus bestimmt und den Eintritt des Virus in die Wirtszelle vermittelt. In dieser Arbeit ist SARS-CoV-2 Spike das Hüllglykoprotein, das für die Produktion von nicht-replikativen SARS-CoV-2-pseudotypisierten Lentiviren verwendet wird.

Kurz gesagt, Verpackungszellen (HEK293T) wurden mit den drei verschiedenen Plasmiden unter Verwendung von Standardmethoden co-transfiziert. Nach 48 h wurde der Überstand, der die PVs enthielt, geerntet, filtriert und bei -80 °C gelagert. Die Infektiosität von SARS-CoV-2-PVs wurde getestet, indem die Expression des Reportergens (Luciferase) in einer Zielzelllinie 48 h nach der Infektion untersucht wurde. Je höher der Wert für relative Lumineszenzeinheiten (RLUs) ist, desto höher ist die Infektions-/Transduktionsrate. Darüber hinaus wurden die infektiösen PVs zu den seriell verdünnten Serumproben hinzugefügt, um den Neutralisationsprozess des Eintritts von Pseudoviren in die Zielzellen zu untersuchen, gemessen als Verringerung der RLU-Intensität: niedrigere Werte entsprechen einer hohen neutralisierenden Aktivität.

Introduction

Pseudotypisierte Viren (PVs) sind molekulare Werkzeuge, die in der Mikrobiologie verwendet werden, um Wirt-Virus- und Pathogen-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen 1,2,3,4. PVs bestehen aus einem inneren Teil, dem viralen Kern, der das virale Genom schützt, und einem äußeren Teil, den Hüllglykoproteinen auf der Oberfläche des Virus, die den Tropismus definieren5. Ein Pseudovirus ist in der Zielzelle replikationsunfähig, da es nicht die gesamte genetische Information enthält, um neue Viruspartikel zu erzeugen. Diese Kombination von besonderen Eigenschaften macht PVs zu einer sicheren Alternative zu einem Wildtyp-Virus. Wildtypviren hingegen sind hochpathogen und können in BSL 2-Laboren nicht zur Analyse verwendet werden6.

Die Infektiosität von PVs kann durch ein Reportergen überwacht werden, das in der Regel für ein fluoreszierendes Protein (GFP, RFP, YFP) oder ein Enzym kodiert, das chemilumineszierende Produkte (Luciferase) produziert. Dieses ist in einem der Plasmide enthalten, die für die PV-Produktion verwendet werden, und wird in das Genom des Pseudoviruseingebaut 7.

Derzeit gibt es verschiedene Arten von PV-Kernen, darunter lentivirale Partikel, die auf dem Genom von HIV-1 basieren. Der große Vorteil von HIV-1-basierten PVs gegenüber anderen Plattformen ist ihr intrinsischer Integrationsprozess im Genom der Zielzelle8. Obwohl HIV-1 ein hochansteckendes Virus ist und der Erreger von AIDS ist, sind diese lentiviralen Vektoren aufgrund der umfangreichen Optimierungsschritte im Laufe der Jahre sicher in der Anwendung. Optimale Sicherheitsbedingungen wurden mit der Einführung von lentiviralen Vektoren der 2. Generation erreicht, bei denen virale Gene depleutet wurden, ohne die Transduktionsfähigkeit zu beeinflussen9. Die 3. und 4. Generation trugen mit der weiteren Aufspaltung des viralen Genoms in separate Plasmide zur erhöhten Sicherheit des lentiviralen Vektorhandlings bei10,11. Die neuesten Generationen von PVs werden in der Regel zur Herstellung von lentiviralen Vektoren für die Gentherapie eingesetzt.

PVs können verwendet werden, um Interaktionen zwischen Viren und Wirtszellen sowohl während der Produktions- als auch während der Infektionsphase zu untersuchen. PVs werden insbesondere in Pseudovirus-Neutralisationsassays (PVNA) eingesetzt. PVNAs werden umfassend validiert, um das Neutralisationspotenzial von Serum oder Plasma zu bewerten, indem sie auf das virale Glykoprotein auf der Hülle des PV abzielen12,13. Die Neutralisationsaktivität, ausgedrückt als Hemmkonzentration 50 (IC50), ist definiert als die Verdünnung von Serum/Plasma, die 50 % des Eintritts von Viruspartikeln blockiert14. In diesem Protokoll beschrieben wir den Aufbau einer PVNA, um die Antikörperaktivität gegen das Severe Acute Respiratory Syndrome – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in Seren zu testen, die vor und nach Erhalt einer Auffrischungsimpfung gesammelt wurden.

Protocol

Das vorliegende Protokoll wurde von der Ethikkommission der Universität Verona genehmigt und folgt den Richtlinien dieser Kommission (Zulassungsprotokoll Nr. 1538). Von den an der Studie teilnehmenden Probanden wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Vollblutproben wurden von Freiwilligen des Gesundheitspersonals (HCW) gesammelt, die gerade dabei waren, Anti-SARS-CoV-2-Impfstoffe zu erhalten. Diese Proben wurden in Kunststoffröhrchen mit Antikoagulanzien für die anschließende Isolierung von S…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt die Produktion von SARS-CoV-2-PVs und eine nachgelagerte Anwendung dieser PVs zur Analyse der Neutralisationsaktivität von Serum/Plasma von Probanden, die eine Anti-COVID-19-Impfung erhalten17. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angewendet werden, um Pseudotypen jeder besorgniserregenden SARS-CoV-2-Variante (VOC) herzustellen, um die Entwicklung der neutralisierenden Reaktion zu testen. Obwohl dieses Protokoll die Untersuchung der humoralen Immunantwort nach einer C…

Discussion

Obwohl die Verwendung eines Wildtyp-Virus die tatsächliche Infektion simuliert, sind lentivirale PVs eine sicherere Option, um die Mechanismen zu untersuchen, die mit dem Eindringen und der Infektion von Viren verbunden sind, ohne die strengen Sicherheitsanforderungen, die für die Arbeit mit pathogenen Viren erforderlich sind 4,20,21. PVs bestehen aus einem replikationsdefekten Viruskern, der von der Oberflächenhülle eines p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir würdigen den Beitrag der freiwilligen Helfer im Gesundheitswesen. Dieses Projekt wurde vom Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italien, unterstützt. AR und DZ wurden durch PRIN2022 (EU-Fördermittel; NextGenerationEU)

Materials

0.45 μm filter SARSTEDT 83 1826
6-well plate SARSTEDT 83 3920
96-well plate SARSTEDT 8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck 10403892
Black Opaque 96-well Microplate Perkin Elmer 60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium  SIGMA-ALDRICH D6546 – 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) AUROGENE AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum AUROGENE AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7 graphpad dotmatics NA In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells ATCC CRL-3216 HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine  AUROGENE AU-X0550-100
Luminometer – Victor3 Perkin Elmer HH35000500 In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer' 
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' 
p8.91 packaging plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin AUROGENE AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) SIGMA-ALDRICH 408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) Addgene 145839 This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid Addgene pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6066759 In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x AUROGENE AU-L0949-100

References

  1. Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
  2. Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
  3. McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
  4. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
  5. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
  6. D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
  7. Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
  8. Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
  9. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  10. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  11. Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
  12. Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
  13. Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
  14. Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
  15. Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
  16. Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
  17. Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
  18. Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
  19. Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
  20. Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
  21. Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
  22. Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
  23. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
  24. Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
  25. Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
  26. Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
  27. Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
  28. Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
  29. Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
  30. Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
  31. Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
  32. Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
  33. da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
  34. Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
  35. Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).

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Fantoni, T., Bissoli, M., Stefani, C., Voi, M., Dabija, A., Casula, R., Minafra, D. L., da Fonseca Palmeira, J., Argañaraz, E. R., Mayora-Neto, M., Temperton, N. J., Zipeto, D., Ruggiero, A. Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay. J. Vis. Exp. (201), e65658, doi:10.3791/65658 (2023).

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