Summary

Создание модели мышей ороназальной фистулы

Published: September 08, 2023
doi:

Summary

В данной статье описана пошаговая процедура создания модели мышей с ороназальным свищом. Ороназальный свищ был создан путем использования горячего офтальмологического прижигания, чтобы повредить срединную часть твердого неба, что привело к образованию отверстия между ротовой и носовой полостями.

Abstract

В данном исследовании представлен метод, использующий офтальмологическое прижигание с подогревом для разработки жизнеспособной модели исследования ороназальных свищей. Мыши C57BL/6 были использованы для создания модели ороназальной фистулы (ONF). Для создания ОНФ мышей обезболивали, обездвиживали и обнажали их твердые нёба. Во время хирургического вмешательства было индуцировано повреждение слизистой оболочки на всю толщину 2,0 х 1,5 мм по средней линии твердого неба с помощью офтальмологического прижигания. Для обеспечения успеха эксперимента было крайне важно контролировать размер ОНФ и свести к минимуму кровотечение. Верификация эффективности модели ОНФ проводилась на 7-е сутки после операции, включая как анатомическую, так и функциональную оценку. Наличие носовой перегородки в полости рта и отток стерильной воды из ноздрей при инъекции в ротовую полость подтвердили успешное создание модели ОНФ. Модель продемонстрировала практичную и успешную ороназальную фистулу, характеризующуюся низким уровнем смертности, значительными изменениями массы тела и минимальными вариациями размера ОНФ. В будущих исследованиях может быть рассмотрен вопрос о применении этой методологии для выяснения механизмов заживления ран неба и изучения новых методов лечения ороназальных свищей.

Introduction

Ороназальный свищ (ОНФ), аномальное отверстие между полостью рта и носом, клинически проявляется как дефект в структурной области от альвеолярного отростка до язычка, который обычно возникает как осложнение после коррекции расщелины неба1. У пациентов с ОНФ наблюдается пищевой рефлюкс, нарушения артикуляции и нарушения функции глоточной ки, что значительно влияет на качество их жизни 2,3,4. Частота послеоперационного ОНФ колеблется от 2,4% до 55% из-за таких факторов, как ширина расщелины, тип Во и хирургический метод 5,6,7,8. Кроме того, частота рецидивов после операции ОНФ высока и колеблется от 0% до 43%9.

Несколько новых методов лечения в последнее время показали многообещающие результаты в области ОНФ, включая различные материалы, лекарства и новые методы 10,11,12,13,14,15,16,17. Точная оценка терапевтических эффектов имеет важное значение, поскольку она обеспечивает основу для выбора и дальнейшей разработки методов лечения ОНФ. Тем не менее, получение достоверной оценки в краткосрочной перспективе терапевтических эффектов, отличных от хирургического вмешательства, является сложной задачей, поскольку характеристики ОНФ различаются у разных пациентов. Таким образом, для проверки эффективности этих методов лечения необходимо создание модели заболевания ОНФ.

В течение нескольких десятилетий исследователи создавали модель ороназальной фистулы (ОНФ) у различных видов животных, включая крыс18,19, поросят 20,21, минипигов22 и собак 23, поскольку эти виды обладают значительным твердым нёбом, подходящим для хирургических манипуляций. Тем не менее, мыши имеют генетическую последовательность и весь геном, похожий на человеческий, что делает их важной моделью для исследования и разработки новых лекарств24,25,26. Кроме того, мыши практически не отличаются от партии к партии, что делает их благоприятным выбором для создания модели ONF12,13,27.

Однако детальные шаги по созданию ОНФ не были описаны, а стабильность размера ОНФ не была учтена. Кроме того, верификация образования ОНФ основывалась исключительно на наблюдении28, без обеспечения прямой связи между ротовой и носовой полостями. Это не было продемонстрировано другими способами, такими как потеря мышью массы тела из-за трудностей с приемом пищи, вызванных ОНФ. Кроме того, не учитывалась нормальная вариабельность размера раны, что имеет решающее значение для исследований лекарств или материалов, которые способствуют или ингибируют заживление ран. Таким образом, существует острая необходимость в создании стабильной и валидированной модели ONF.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы разработать практическую модель ОНФ, которая решает вышеупомянутые вопросы, с надеждой, что этот протокол послужит основой для будущих исследований механизмов заживления небных ран и новых методов лечения ОНФ.

Protocol

Все процедуры на животных в этом исследовании были рассмотрены и одобрены Этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета. Для настоящего исследования использовали взрослых мышей линии C57BL/6 (самок). 1. Хирургическая подготовка</stron…

Representative Results

Чтобы оценить осуществимость и стабильность этого экспериментального метода, та же процедура была проведена на десяти мышах, и были проведены наблюдения за смертностью, изменениями размера раны, массы тела и гистологическим анализом. Мышей усыпили на 7-й день. Процедура …

Discussion

Исследователи изучили различные материалы, лекарства и новые методы лечения ОНФ 10,11,12,13,14,15,16,17. Благодаря достижениям в области хирургическ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Программой исследований и разработок Западно-Китайской стоматологической больницы Сычуаньского университета (RD-02-202107), Программой поддержки науки и технологий провинции Сычуань (2022NSFSC0743) и грантом Сычуаньского фонда постдокторантуры (TB2022005) Х. Хуану.

Materials

Germinator Electron Microscopy Sciences  66118-20 Heating and disinfection equipment
Latex gloves Allmed or similar
Lights Olympus A1813
Meloxicam MedChemExpress HY-B0261 crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers) Jiangsu Tonghui Medical Devices Co. M-Y-0087 Surgical instrument
Ophthalmologic cautery Suqian Wenchong Medical Equipment Co. 1.00234E+13 Surgical instrument
Sterile cotton, Yancheng Begu Technology Co. or similar
Sterile metal foil Biosharp or similar
Sterile sheets 3M XH003801129 or similar
Surgical drapes Yancheng Begu Technology Co. or similar
Syringes Yancheng Begu Technology Co. S-015301 or similar
Tape Bkmamlab or similar
Temperature maintenance device Harvard Apparatus  LE-13-2104
Zoletil50 Virbac 80 mg/kg

References

  1. Alonso, V., et al. Three-layered repair with a collagen membrane and a mucosal rotational flap reinforced with fibrine for palatal fistula closure in children. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 127, 109679 (2019).
  2. Garg, R., Shah, S., Uppal, S., Mittal, R. K. A statistical analysis of incidence, etiology, and management of palatal fistula. National Journal of Maxillofacial Surgery. 10 (1), 43-46 (2019).
  3. Mahajan, R. K., Kaur, A., Singh, S. M., Kumar, P. A retrospective analysis of incidence and management of palatal fistula. Indian Journal of Plastic Surgery. 51 (3), 298-305 (2018).
  4. Huang, H., et al. Validation of the Chinese Velopharyngeal Insufficiency Effects on Life Outcomes Instrument. Laryngoscope. 129 (11), E395-E401 (2019).
  5. Sakran, K. A., et al. Evaluation of Postoperative Outcomes in Two Cleft Palate Repair Techniques without Relaxing Incisions. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2023).
  6. Sakran, K. A., et al. Evaluation of late cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. Journal of Stomatology, Oral and Maxillofacial Surgery. 124 (4), 101403 (2023).
  7. Sakran, K. A., et al. The Sommerlad-Furlow modified palatoplasty technique: postoperative complications and implicating factors. Laryngoscope. 133 (4), 822-829 (2023).
  8. Sakran, K. A., et al. Early cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. , (2022).
  9. Chen, J., Yang, R., Shi, B., Xu, Y., Huang, H. Obturator manufacturing for oronasal fistula after cleft palate repair: a review from handicraft to the application of digital techniques. Journal of Functional Biomaterials. 13 (4), 251 (2022).
  10. Yussif, N., Wagih, R., Selim, K. Propylene mesh versus acrylic resin stent for palatal wound protection following free gingival graft harvesting: a short-term pilot randomized clinical trial. BMC Oral Health. 21 (1), 208 (2021).
  11. Miron, R. J., et al. Platelet-rich fibrin and soft tissue wound healing: a systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (1), 83-99 (2017).
  12. Ballestas, S. A., et al. Improving hard palate wound healing using immune modulatory autotherapies. Acta Biomaterialia. 91, 209-219 (2019).
  13. Ferreira, C. L., et al. Electrical stimulation enhances early palatal wound healing in mice. Archives of Oral Biology. 122, 105028 (2021).
  14. Lindley, L. E., Stojadinovic, O., Pastar, I., Tomic-Canic, M. Biology and Biomarkers for Wound Healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 18s-28s (2016).
  15. Xu, Y., et al. Rapid Additive Manufacturing of a Superlight Obturator for Large Oronasal Fistula in Pediatric Patient. Laryngoscope. 133 (6), 1507-1512 (2022).
  16. Leenstra, T. S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. The healing process of palatal tissues after palatal surgery with and without implantation of membranes: an experimental study in dogs. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 9 (5), 249-255 (1998).
  17. In de Braekt, M. M., van Alphen, F. A., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. Wound healing and wound contraction after palatal surgery and implantation of poly-(L-lactic) acid membranes in beagle dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 50 (4), 359-365 (1992).
  18. Suragimath, G., Krishnaprasad, K. R., Moogla, S., Sridhara, S. U., Raju, S. Effect of carbonated drink on excisional palatal wound healing: A study on Wistar rats. Indian Journal of Dental Research. 21 (3), 330-333 (2010).
  19. Zhu, T., Park, H. C., Son, K. M., Yang, H. -. C. Effects of dimethyloxalylglycine on wound healing of palatal mucosa in a rat model. BMC Oral Health. 15 (1), 60 (2015).
  20. Kirschner, R. E., et al. Repair of oronasal fistulae with acellular dermal matrices. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 1431-1440 (2006).
  21. Rohleder, N. H., et al. Repair of oronasal fistulae by interposition of multilayered amniotic membrane allograft. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 172-181 (2013).
  22. Kesting, M. R., et al. Repair of oronasal fistulas with human amniotic membrane in minipigs. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 48 (2), 131-135 (2010).
  23. Ayvazyan, A., et al. Collagen-gelatin scaffold impregnated with bFGF accelerates palatal wound healing of palatal mucosa in dogs. Journal of Surgical Research. 171 (2), e247-e257 (2011).
  24. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
  25. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
  26. Shan, L., Flavell, R. A., Herndler-Brandstetter, D. Development of humanized mouse models for studying human NK cells in health and disease. Methods in Molecular Biology. 2463, 53-66 (2022).
  27. Keswani, S. G., et al. Role of salivary vascular endothelial growth factor (VEGF) in palatal mucosal wound healing. Wound Repair and Regeneration. 21 (4), 554-562 (2013).
  28. Amanso, A. M., et al. Local delivery of FTY720 induces neutrophil activation through chemokine signaling in an oronasal fistula model. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (2), 160-174 (2021).
  29. Antiorio, A. T. F. B., et al. Administration of meloxicam to improve the welfare of mice in research: a systematic review (2000 – 2020). Veterinary Research Communications. 46 (1), 1-8 (2022).

Play Video

Cite This Article
Chen, J., Yin, J., Zhang, S., Zhuang, S., Yang, R., Xu, Y., Zheng, Q., Shi, B., Huang, H. Establishment of an Oronasal Fistula Mice Model. J. Vis. Exp. (199), e65578, doi:10.3791/65578 (2023).

View Video