Aquí se presenta un protocolo efectivo de perfusión sanguínea rápida para preparar muestras de tejido de ranas con garras africanas para estudios de transcriptómica y proteómica.
Xenopus ha sido poderosos organismos modelo para comprender el desarrollo y la enfermedad de los vertebrados durante más de 100 años. Aquí, se define un protocolo de perfusión sanguínea rápida en Xenopus, dirigido a una reducción consistente y drástica de la sangre dentro de todos los tejidos. La perfusión se lleva a cabo insertando una aguja directamente en el ventrículo del corazón y bombeando solución salina tamponada con fosfato heparinizado (PBS) a través del sistema vascular. El procedimiento se puede completar en aproximadamente 10 minutos por animal. La sangre está dominada por unas pocas proteínas y tipos de células muy abundantes, creando numerosos problemas ya que estas proteínas enmascaran la mayoría de las otras moléculas y tipos de células de interés. La caracterización reproducible de tejidos adultos de Xenopus con proteómica cuantitativa y transcriptómica unicelular se beneficiará de la aplicación de este protocolo antes del muestreo de órganos. Los protocolos para el muestreo de tejidos se definen en documentos complementarios. Estos procedimientos están dirigidos a la estandarización de prácticas en Xenopus de diferente sexo, edad y estado de salud, específicamente X. laevis y X. tropicalis.
La perfusión de todo el cuerpo de los anfibios se completa rutinariamente con fines de preservación y fijación 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos procedimientos ocurren a una velocidad que limita el número de muestras frescas que se pueden tomar por animal. El objetivo de este trabajo es desarrollar un protocolo efectivo de perfusión sanguínea en Xenopus, priorizando la velocidad de la técnica. El protocolo toma menos de 10 min por animal para X. tropicalis y menos de 15 min por X. laevis animal. Las prioridades secundarias son la facilidad de replicación y el uso de equipos fáciles de adquirir para que las muestras de alta calidad puedan compartirse ampliamente entre los laboratorios Xenopus.
Las ranas Xenopus se utilizan ampliamente en la investigación biomédica para estudiar procesos biológicos y patológicos fundamentales conservados en todas las especies. Este tetrápodo tiene una relación evolutiva más cercana con los mamíferos que otros modelos acuáticos, con pulmones, un corazón de tres cámaras y extremidades con dedos. La comunidad internacional utiliza eficazmente Xenopus para obtener una comprensión más profunda de las enfermedades humanas a través de modelos de enfermedades en profundidad y análisis moleculares de la función génica relacionada con la enfermedad. Las numerosas ventajas de Xenopus como modelo animal los convierten en herramientas invaluables para estudiar las bases moleculares del desarrollo humano y la enfermedad; Estas ventajas incluyen: gran tamaño de ovocitos y embriones, alta fecundidad, facilidad de alojamiento, rápido desarrollo externo y facilidad de manipulación genómica. Se ha estimado que Xenopus comparte ~ 80% de los genes identificados de enfermedades humanas7.
En comparación con los modelos populares de mamíferos, Xenopus es un modelo rápido y rentable, con la facilidad de eliminación de morfolinos y la disponibilidad de transgénicos eficientes y mutaciones genéticas dirigidas utilizando CRISPR8. La espectrometría cuantitativa de masas y la transcriptómica unicelular se han aplicado con éxito a embriones de Xenopus9,10, pero un atlas celular reciente de Xenopus laevis muestra que la composición de la mayoría de los tejidos está dominada por los tipos de células sanguíneas 11. Al desarrollar una técnica que exangüe el tejido a un ritmo rápido y utilizando medios refrigerados, la frescura de la muestra se ve mínimamente afectada por la perfusión. Esto es particularmente importante para aplicaciones donde el objetivo es perfilar la expresión de ARNm o proteína fisiológicamente imperturbable.
Este protocolo describe las técnicas tradicionales de disección para acceder a la cavidad celómica. Otras técnicas también son aceptables, siempre que causen un daño mínimo a los tejidos, el corazón sea accesible y el pulmón y el estómago sean visibles. Del mismo modo, la mayoría de las herramientas de disección enumeradas se pueden sustituir fácilmente con elementos comparables.
Si bien se han hecho intentos para optimizar la eficacia de este procedimiento, los resultados pueden …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la subvención OD R24 de los NIH OD031956 y la subvención R01 del NICHD HD073104. Agradecemos a Darcy Kelly por las útiles discusiones y los aportes iniciales sobre este protocolo. También nos gustaría agradecer a Samantha Jalbert, Jill Ralston y Wil Ratzan por su asistencia y apoyo, así como a nuestros tres revisores anónimos por sus comentarios.
5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
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Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
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