Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

Summary

Vi presentiamo passo-passo le istruzioni per la generazione di chimere neonatale e la dissezione e la preparazione del timo per ex vivo imaging 2-Photon Microscopia.

Abstract

Microscopia a due fotoni (TPM) ci permette di immagine in profondità nel timo e documentare gli eventi che sono importanti per lo sviluppo timocita. Per seguire la migrazione degli individui in una folla di timociti, che generano chimere neonatale dove derivano meno dell'uno per cento dei timociti da un donatore che è transgenico per una proteina ubiquitariamente espressa fluorescente. Per generare queste chimere parziale ematopoietiche, i destinatari neonatale vengono iniettati con midollo osseo tra i 3-7 giorni di età. Dopo 4-6 settimane, il mouse è sacrificato ed il timo è attentamente sezionato e bissected preservando l'architettura del tessuto che verrà ripreso. Il timo è incollato su un vetrino in preparazione ex vivo di immagini da TPM. Durante l'imaging del timo è tenuto in DMEM senza rosso fenolo che è perfuso con il 95% di ossigeno e anidride carbonica del 5% e riscaldato a 37 ° C. Usando questo approccio, possiamo studiare gli eventi necessari per la generazione di un diverso repertorio delle cellule T.

Protocol

Trasferimento adottivi Iniettare neonati con 50-100ul di midollo osseo con una siringa per insulina 2-4 volte durante i primi 3-7 giorni di vita, con un finale donatore-to-host rapporto di 1:1. Mirare a un sito di iniezione sotto lo sterno e la gabbia toracica, ma soprattutto l'intestino e lo stomaco. Inserire l'ago quanto basta per penetrare il peritoneo, attenzione a non forare il diaframma. Non è raro che per alcuni del midollo osseo per essere persi durante l'iniezione. È possibile ridurre la perd…

Discussion

Immagini a due fotoni nel timo ci consente di esaminare in vita, gli organi intatti le interazioni e le migrazioni che sono alla base eventi di selezione all'interno del timo.