Summary

Поведенческая характеристика мышиной модели синдрома Ангельмана

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

В данной рукописи представлен набор высоко воспроизводимых поведенческих тестов для валидации мышиной модели синдрома Ангельмана.

Abstract

В этой рукописи описывается батарея поведенческих тестов, доступных для характеристики фенотипов, подобных синдрому Ангельмана (АС), в установленной мышиной модели АС. Мы используем парадигму ротародного обучения, детальный анализ походки и тест на строительство гнезда для выявления и характеристики двигательных нарушений животных. Мы тестируем эмоциональность животных в открытом поле и на повышенных и лабиринтных тестах, а также аффект в тесте на подвеску хвоста. Когда мыши с синдромом Аспергера тестируются в открытом поле, результаты следует интерпретировать с осторожностью, поскольку двигательные дисфункции влияют на поведение мышей в лабиринте и изменяют показатели активности.

Воспроизводимость и эффективность представленных поведенческих тестов уже была подтверждена на нескольких независимых линиях мышей Uba3a с различными вариантами нокаута, что делает этот набор тестов отличным инструментом валидации в исследованиях АС. Модели с соответствующей конструкцией и валидностью лица потребуют дальнейших исследований для выяснения патофизиологии заболевания и позволят разработать причинно-следственные методы лечения.

Introduction

Синдром Ангельмана (АС) является редким заболеванием развития нервной системы. Наиболее распространенным генетическим происхождением АС является большая делеция участка 15q11-q13 хромосомы материнского происхождения, которая обнаруживается почти у 74%пациенток1. Делеция этой области приводит к потере UBE3A, основного возбудителя АС, кодирующего убиквитин-лигазу E3. Отцовский аллель гена UBE3A в нейронах заглушается в процессе, известном как импринтинг. Как следствие, отцовский импринтинг гена допускает только материнскую экспрессию в центральной нервной системе (ЦНС)2. Таким образом, делеция гена UBE3A из хромосомы материнского происхождения приводит к развитию симптомов АС. У людей АС проявляется в возрасте около 6 месяцев, с задержкой развития, которая сохраняется на всех этапах развития и приводит к тяжелым изнурительным симптомам у больных 3,4. Основные симптомы расстройства включают дефицит мелкой и крупной моторики, в том числе судорожную атаксическую походку, серьезные нарушения речи и умственную отсталость. Примерно 80% пациентов с синдромом Аспергера также страдают нарушениями сна и эпилепсией. На сегодняшний день единственным доступным лечением являются симптоматические препараты, которые уменьшают эпилептические припадки и улучшают качествосна1. Таким образом, разработка надежных животных моделей с воспроизводимыми поведенческими фенотипами наряду с уточненным анализом фенотипирования будет иметь важное значение для выяснения патофизиологических механизмов расстройства и поиска эффективных лекарств и методов лечения.

Сложность человеческого заболевания, поражающего ЦНС, требует, чтобы модельные организмы обладали сопоставимым геномом, физиологией и поведением. Мыши популярны в качестве модельных организмов из-за их короткого репродуктивного цикла, небольшого размера и относительной простоты модификации ДНК. В 1984 году Пол Уилнер предложил три основных критерия валидации модели заболевания: конструкт, лицо и прогностическая валидность, которые используются дляопределения ценности модели. Проще говоря, конструктная валидность отражает биологические механизмы, ответственные за развитие расстройства, валидность лица повторяет его симптомы, а прогностическая валидность описывает реакцию модели на терапевтические препараты.

Чтобы придерживаться вышеуказанных принципов, мы выбрали наиболее распространенную генетическую этиологию, большую делецию материнского локуса 15q11.2-13q, включая ген UBE3A, для создания мышей модели AS. Мы использовали технику CRISPR/Cas9 для удаления участка длиной 76 225.н., охватывающего весь ген UBE3A, охватывающего как кодирующие, так и некодирующие элементы гена, у мышейиз фона C57BL/6N6. Затем мы скрещивали животных для получения гетерозиготных мышей UBE3A+/−. Для валидации модели мы использовали животных от скрещивания самок UBE3A+/− и самцов дикого типа для получения потомства UBE3A+/- (штамм C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph, позже присвоенный как UBE3A mGenedel/+) и контрольные однопометники. Мы проверили их мелкую и крупную моторику, эмоциональность и аффект, чтобы повторить основные симптомы синдрома Аспергера. В предыдущей статье мы также оценивали когнитивные функции животных, так как пациенты с синдромом Аспергера также страдают умственнойотсталостью6. Тем не менее, мы не обнаружили когнитивных нарушений у мышей UBE3AmGenedel/+, возможно, из-за молодого возраста животных на момент тестирования7. Более позднее обследование старших животных, в возрасте около 18 недель, выявило дефицит поведенческой гибкости во время реверсивного обучения в парадигме предпочтения места. Однако сложность используемого оборудования для такого анализа требует отдельного методологического модуля, который здесь не включен.

Представленные здесь поведенческие тесты относятся к распространенным инструментам фенотипирования в генетических исследованиях, благодаря их высокой прогностической ценности и достаточной конструктной валидности 8,9,10. Мы использовали эти тесты для валидации мышиной модели АС путем повторения основных симптомов заболевания человека воспроизводимым, независимым от возраста образом. Эмоциональность животного оценивалась в тестах повышенного плюса лабиринта и открытого поля. Оба этих теста основаны на конфликте приближения-избегания, когда животные исследуют новую среду в поисках пищи, укрытия или возможностей для спаривания, одновременно избегая анксиогенных компартментов11. Кроме того, тест в открытом поле используется для проверки локомоторной активности мыши8. Тест на подвеску хвоста широко используется в исследованиях депрессии для скрининга новых антидепрессантов или депрессивных фенотипов в моделях нокаутамышей 12. Этот тест оценивает отчаяние, которое животные развивают с течением времени в неизбежной ситуации. Моторика и детальные характеристики походки определялись на ротароде и в DigiGait соответственно. Выносливость животного на ускорительном стержне характеризует его навыки равновесия и координации движений, в то время как детальный анализ шаговых паттернов мыши является чувствительной оценкой нервно-мышечных нарушений, связанных со многими нейрогенеративными двигательными расстройствами13,14,15. Тест на измельчение гнезд является частью стандартной методики выявления импульсивного поведения грызунов, и, поскольку он использует естественное поведение грызунов, он указывает на благополучие животного16,17.

Размер экспериментальных групп был достигнут в результате компромисса, направленного на выполнение требований правила 3R и эффективное использование показателей размножения колоний. Однако для получения статистической мощности в группах насчитывалось не менее 10 особей, что обусловлено установлением достаточного количества размножающихся пар. К сожалению, племенная продуктивность не всегда приводила к достаточному количеству животных.

Protocol

Все животные и эксперименты, использованные в этом исследовании, прошли этическую экспертизу и были проведены в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU. Исследование было одобрено Чешской центральной комиссией по защите животных. Мышей помещали в индивидуально вентилируемые кле…

Representative Results

Испытания в лабиринте на возвышенности и в открытом грунтеТесты EPM и OF используют естественную склонность грызунов исследовать новые среды18,19. Исследование регулируется конфликтом приближения-избегания, когда грызуны выбирают между исследо…

Discussion

Модели АС, созданные на различных линиях мышей, обычно проверяются с помощью тестов эмоционального состояния, двигательных функций и когнитивных способностей животных, чтобы облегчить сравнение с человеческими симптомами31,32. Двигательный дефицит в мод…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Чешской академией наук RVO 68378050, LM2018126 Чешским центром феноменомики при поддержке MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Модернизация Чешского центра феноменомики: развитие в направлении исследований перевода MEYS и ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II by MEYS и ESIF) и OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (более высокое качество и емкость для трансгенных моделей MEYS и ERDF). Кроме того, это исследование получило финансирование от НПО «Ассоциация генной терапии (ASGENT)», Чехия (https://asgent.org/) и LM2023036 Чешского центра феноменомики, предоставленного Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики.

Materials

Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

References

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman’s syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
  7. Huang, H. -. S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -. C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -. H., Gao, T. -. M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D’Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).

Play Video

Cite This Article
Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

View Video