Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC’s) van Sprague Dawley-ratten.
Volwassen mesenchymale cellen hebben de afgelopen decennia een revolutie teweeggebracht in de moleculaire en celbiologie. Ze kunnen differentiëren in verschillende gespecialiseerde celtypen, naast hun grote vermogen tot zelfvernieuwing, migratie en proliferatie. Vetweefsel is een van de minst invasieve en meest toegankelijke bronnen van mesenchymale cellen. Er is ook gemeld dat het hogere opbrengsten heeft in vergelijking met andere bronnen, evenals superieure immunomodulerende eigenschappen. Onlangs zijn verschillende procedures voor het verkrijgen van volwassen mesenchymale cellen uit verschillende weefselbronnen en diersoorten gepubliceerd. Na het evalueren van de criteria van sommige auteurs, hebben we een methodologie gestandaardiseerd die toepasbaar is voor verschillende doeleinden en gemakkelijk reproduceerbaar. Een pool van stromale vasculaire fractie (SVF) uit perirenaal en epididymaal vetweefsel stelde ons in staat om primaire culturen te ontwikkelen met optimale morfologie en functionaliteit. De cellen werden waargenomen die gedurende 24 uur aan het plastic oppervlak kleefden en vertoonden een fibroblastachtige morfologie, met verlengingen en een neiging om kolonies te vormen. Flowcytometrie (FC) en immunofluorescentie (IF) technieken werden gebruikt om de expressie van de membraanmarkers CD105, CD9, CD63, CD31 en CD34 te beoordelen. Het vermogen van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC’s) om te differentiëren in de adipogene afstamming werd ook beoordeeld met behulp van een cocktail van factoren (4 μM insuline, 0,5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine en 1 μM dexamethason). Na 48 uur werd een geleidelijk verlies van fibroblastoïde morfologie waargenomen en na 12 dagen werd de aanwezigheid van lipidedruppeltjes positief voor olierode kleuring bevestigd. Samenvattend wordt een procedure voorgesteld om optimale en functionele ASC-culturen te verkrijgen voor toepassing in de regeneratieve geneeskunde.
Mesenchymale stamcellen (MSC’s) hebben een sterke invloed gehad op de regeneratieve geneeskunde vanwege hun hoge capaciteit voor zelfvernieuwing, proliferatie, migratie en differentiatie in verschillende cellijnen 1,2. Momenteel richt veel onderzoek zich op hun potentieel voor de behandeling en diagnose van verschillende ziekten.
Er zijn verschillende bronnen van mesenchymale cellen: beenmerg, skeletspieren, vruchtwater, haarzakjes, placenta en vetweefsel, onder anderen. Ze worden verkregen van verschillende soorten, waaronder mensen, muizen, ratten, honden en paarden3. Van beenmerg afgeleide MSC’s (BMSC’s) worden al vele jaren gebruikt als een belangrijke bron van stamcellen in de regeneratieve geneeskunde en als alternatief voor het gebruik van embryonale stamcellen4. Van vetweefsel afgeleide MSC’s, of van vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC’s), zijn echter een belangrijk alternatief met grote voordelen vanwege hun gemak van verzameling en isolatie, evenals de opbrengst van cellen verkregen per gram vetweefsel 5,6. Er is gemeld dat de oogstsnelheid van ASC’s over het algemeen hoger is dan die van BMSCs7. Aanvankelijk werd voorgesteld dat het herstellende/regeneratieve vermogen van ASC’s te wijten was aan hun vermogen om te differentiëren in andere cellijnen8. Onderzoek in de afgelopen jaren heeft echter de primaire rol van paracriene factoren die door ASC’s worden vrijgegeven in hun herstelpotentieelversterkt 9,10.
Vetweefsel (AT), naast het feit dat het een energiereserve is, interageert met het endocriene, nerveuze en cardiovasculaire systeem. Het is ook betrokken bij postnatale groei en ontwikkeling, het onderhoud van weefselhomeostase, weefselherstel en regeneratie. De AT bestaat uit adipocyten, vasculaire gladde spiercellen, endotheelcellen, fibroblasten, monocyten, macrofagen, lymfocyten, preadipocyten en ASC’s. Deze laatste spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun lage immunogeniciteit11,12. ASC’s kunnen worden verkregen door enzymatische vertering en mechanische verwerking of door vetweefselexplantaten. Primaire culturen van ASC’s zijn gemakkelijk te onderhouden, te kweken en uit te breiden. Fenotypische karakterisering van ASC’s is essentieel om de identiteit van de cellen te verifiëren door de expressie van specifieke membraanmarkers te beoordelen met behulp van methoden zoals immunofluorescentie en flowcytometrie13. De International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) en de International Society for Cellular Therapy (ISCT) hebben gedefinieerd dat ASC’s CD73, CD90 en CD105 uitdrukken, terwijl ze de expressie van CD11b, CD14, CD19, CD45 en HLA-DR14 missen. Deze markers, zowel positief als negatief, worden daarom als betrouwbaar beschouwd voor de karakterisering van ASC’s.
Dit project was gericht op het beschrijven van een procedure voor de isolatie en identificatie van volwassen mesenchymale cellen geëxtraheerd uit het AT van ratten, omdat deze bron van cellen geen ethische uitdagingen met zich meebrengt, in tegenstelling tot embryonale stamcellen. Dit stolt de procedure als een haalbare optie vanwege de gemakkelijke toegang en de minimaal invasieve methode in vergelijking met van beenmerg afgeleide stamcellen.
Mesenchymale cellen uit deze weefselbron spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun immunomodulerende mogelijkheden en lage immuunafstoting. Daarom is de huidige studie een fundamenteel onderdeel van toekomstig onderzoek naar hun secretoom en hun toepassing als regeneratieve therapie bij verschillende ziekten, waaronder metabole ziekten zoals diabetes.
In de afgelopen vier decennia sinds de ontdekking van MSC’s hebben verschillende groepen onderzoekers procedures beschreven voor het verkrijgen van MSC’s uit verschillende weefsels en soorten. Een van de voordelen van het gebruik van ratten als diermodel is hun eenvoudige onderhoud en snelle ontwikkeling, evenals het gemak van het verkrijgen van MSC’s uit vetweefsel. Verschillende weefselbronnen zijn beschreven voor het verkrijgen van ASC’s, zoals visceraal, perirenaal, epididymaal en onderhuids vet 12,13,14,15,16.<sup c…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn het Mexicaanse Instituut voor Sociale Zekerheid (IMSS) en het Kinderziekenhuis van Mexico, Federico Gomez (HIMFG) en de Bioterio-medewerkers van de IMSS Research Coordination dankbaar voor de steun die is gegeven om dit project uit te voeren. We danken de National Council of Science and Technology voor de AOC (815290) beurs en Antonio Duarte Reyes voor de technische ondersteuning in het audiovisuele materiaal.
Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |