Summary

Generierung von 3D-Tumorsphäroiden für Wirkstoffevaluierungsstudien

Published: February 24, 2023
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Summary

Dieser Artikel demonstriert eine standardisierte Methode zur Konstruktion dreidimensionaler Tumorsphäroide. Eine Strategie zur Sphäroidbeobachtung und bildbasierten Deep-Learning-Analyse unter Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystems wird ebenfalls beschrieben.

Abstract

In den letzten Jahrzehnten wurden neben monolayerkultivierten Zellen auch dreidimensionale Tumorsphäroide als potenziell leistungsfähiges Werkzeug für die Evaluierung von Krebsmedikamenten entwickelt. Den herkömmlichen Kulturmethoden fehlt jedoch die Möglichkeit, die Tumorsphäroide auf dreidimensionaler Ebene homogen zu manipulieren. Um diese Einschränkung zu beheben, stellen wir in dieser Arbeit eine bequeme und effektive Methode zur Konstruktion von Tumorsphäroiden mittlerer Größe vor. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode der bildbasierten Analyse unter Verwendung einer auf künstlicher Intelligenz basierenden Analysesoftware, die die gesamte Platte scannen und Daten über dreidimensionale Sphäroide erhalten kann. Es wurden mehrere Parameter untersucht. Durch die Verwendung einer Standardmethode zur Konstruktion von Tumorsphäroiden und eines Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analysesystems kann die Effektivität und Genauigkeit von Arzneimitteltests, die an dreidimensionalen Sphäroiden durchgeführt werden, drastisch gesteigert werden.

Introduction

Krebs ist eine der am meisten gefürchteten Krankheiten, nicht zuletzt wegen seiner hohen Sterblichkeitsrate1. In den letzten Jahren hat sich die Möglichkeit, Krebs zu behandeln, durch die Einführung neuer Therapien erhöht 2,3,4,5. Zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle werden verwendet, um Krebs im Labor zu untersuchen. 2D-Modelle können jedoch nicht alle wichtigen Parameter, die auf eine Antitumorsensitivität hinweisen, sofort und genau beurteilen. Daher können sie die In-vivo-Wechselwirkungen in der Arzneimitteltherapieprüfungnicht vollständig abbilden 6.

Seit 2020 hat der globale Markt für dreidimensionale (3D) Kulturen stark zugenommen. Laut einem Bericht von NASDAQ OMX wird der globale Wert des Marktes für 3D-Zellkulturen bis Ende 2025 2,7 Milliarden US-Dollar übersteigen. Im Vergleich zu 2D-Kulturmethoden weist die 3D-Zellkultivierung vorteilhafte Eigenschaften auf, die nicht nur für Proliferation und Differenzierung, sondern auch für das Langzeitüberleben optimiert werden können 7,8. Auf diese Weise können zelluläre Mikroumgebungen in vivo simuliert werden, um eine genauere Tumorcharakterisierung sowie ein metabolisches Profiling zu erhalten, so dass genomische und Proteinveränderungen besser verstanden werden können. Aus diesem Grund sollten 3D-Testsysteme nun in die allgemeine Arzneimittelentwicklung einbezogen werden, insbesondere in solche, die sich auf das Screening und die Bewertung neuartiger Antitumormedikamente konzentrieren. Dreidimensionale Wucherungen von immortalisierten etablierten Zelllinien oder primären Zellkulturen in Sphäroidstrukturen besitzen in vivo Merkmale von Tumoren wie Hypoxie und Wirkstoffpenetration sowie Zellinteraktion, -antwort und -resistenz und können als stringentes und repräsentatives Modell für die Durchführung von In-vitro-Wirkstoff-Screenings angesehen werden9,10,11.

Diese 3D-Kulturmodelle leiden jedoch auch unter mehreren Problemen, deren Lösung einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Zellsphäroide können unter Verwendung dieser Protokolle gebildet werden, aber sie unterscheiden sich in bestimmten Details, wie z.B. der Kulturzeit oder dem Einbetten von Gelen12, so dass diese konstruierten Zellsphäroide unter einem begrenzten Größenbereich nicht gut kontrolliert werden können. Die Größe der Sphäroide kann die Konsistenz des Viabilitätstests und der bildgebenden Analyse beeinflussen. Die Wachstumsmikroumgebungen und Wachstumsfaktoren variieren ebenfalls, was aufgrund von Unterschieden in der Differenzierung zwischen den Zellen zu unterschiedlichen Morphologien führen kann13. Es besteht nun ein offensichtlicher Bedarf an einer standardisierten, einfachen und kostengünstigen Methode zur Konstruktion aller Arten von Tumoren mit kontrollierter Größe.

Aus einer anderen Perspektive betrachtet, bleibt das Hochdurchsatz-Screening von 3D-Modellen aus verschiedenen Gründen, wie z. B. der mangelnden Einheitlichkeit in der Position, Größe und Morphologie von Tumorsphäroiden, eine Herausforderung, obwohl homogene Assays und High-Content-Bildgebungsansätze entwickelt wurden, um Morphologie, Viabilität und Wachstumsrate zu bewerten14,15,16.

In dem hier vorgestellten Protokoll listen wir jeden Schritt in der Konstruktion von 3D-Tumorsphäroiden auf und beschreiben eine Methode zur Beobachtung und Analyse von Sphäroiden unter Verwendung eines High-Content-Bildgebungssystems mit hohem Durchsatz, das unter anderem Autofokus, Auto-Imaging und Analyse umfasst. Wir zeigen, wie mit dieser Methode 3D-Tumorsphäroide einheitlicher Größe hergestellt werden können, die für die Hochdurchsatz-Bildgebung geeignet sind. Diese Sphäroide zeigen auch eine hohe Sensitivität gegenüber der Behandlung von Krebsmedikamenten, und morphologische Veränderungen in den Sphäroiden können mit Hilfe von High-Content-Bildgebung beobachtet werden. Zusammenfassend demonstrieren wir die Robustheit dieser Methodik als Mittel zur Generierung von 3D-Tumorkonstrukten für die Wirkstoffbewertung.

Protocol

1. Sphäroide-Konstruktion Anti-Adhäsions-Behandlung der KulturplattePipettieren Sie 100 μl Antihaftreagenz in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit U-förmigem Well-Boden und bewahren Sie sie 10 Minuten lang auf. Nach 10 Minuten das Beschichtungsreagenz absaugen und zweimal mit sterilisiertem PBS waschen. Legen Sie die Kulturplatte bis zur Verwendung in einen Inkubator (37 °C in befeuchteter Luft mit 5 % CO2). Zellvorbereitung, -entnahm…

Representative Results

Abbildung 1A,B zeigt den Prozess, der in dieser Studie zur Konstruktion von Tumorsphäroiden verwendet wird. Wir haben die Zellen zunächst in einer 48-Well-U-Bodenplatte ausgesät. Dieser Schritt ist fast derselbe wie bei der 2D-Zellkultur. Wir hielten die Platte in einem gemeinsamen Inkubator mit Wasser, das die Brunnen umgab, so dass die abgelagerten Zellen begannen, in einem Selbstorganisationsprozess Sphäroide zu bilden. Unter normalen Betriebsbedingungen bildeten sic…

Discussion

Die Mikroumgebung spielt eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum. Es kann die Bereitstellung extrazellulärer Matrices, Sauerstoffgradienten, Ernährung und mechanische Interaktion beeinflussen und damit die Genexpression, Signalwege und viele Funktionen von Tumorzellen beeinflussen 19,20,21. In vielen Fällen erzeugen 2D-Zellen solche Effekte nicht oder sogar gegenteilige Effekte, was die Bewertung von medikamentösen Behandlung…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken allen Mitgliedern unserer Labore für ihre kritischen Anregungen und Anregungen. Diese Forschung wurde durch das Schlüsselprojekt der Jiangsu Commission of Health (K2019030) unterstützt. Die Konzeptualisierung wurde von C.W. und Z.C. durchgeführt, die Methodik wurde von W.H. und M.L. durchgeführt, die Untersuchung wurde von W.H. und M.L. durchgeführt, die Datenkuratierung wurde von W.H., Z.Z., S.X. und M.L. durchgeführt, die ursprüngliche Entwurfserstellung wurde von Z.Z., J.Z., S.X., W.H. durchgeführt. und X.L., die Überprüfung und Redaktion wurde von Z.C. durchgeführt, die Projektverwaltung von C.W. und Z.C. und die Mittelakquise von C.W. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Materials

0.5-10 μL Pipette tips AXYGEN T-300
1.5 mL Boil proof microtubes Axygen MCT-150-C
100-1000μL Pipette tips KIRGEN KG1313
15 mL Centrifuge Tube Nest 601052
200 μL Pipette tips AXYGEN T-200-Y
3D gel Avatarget MA02
48-well U bottom Plate Avatarget P02-48UWP
50 mL Centrifuge Tube Nest 602052
Alamar Blue Thermo  DAL1100
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL #07010
Certified FBS BI 04-001-1ACS
Deionized water aladdin W433884-500ml
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Gibco 11965-092
DMSO sigma D2650-100ML
Excel sofware  Microsoft office
Graphpad prism sofware  GraphPad software 
High Content Microscope and SMART system Avatarget 1-I01
Image J software National Institutes of Health
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) Gibco 51300-044
Parafilm Bemis PM-996
PBS Solarbio P1020
Penicillin/streptomycin Sol Gibco 15140-122
RPMI 1640 Gibco 11875-093
Scientific Fluoroskan Ascent Thermo Fluoroskan Ascent
T25 Flask JET Biofil TCF012050
Trypsin, 0.25% (1X) Hyclone SH30042.01

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Cite This Article
Hou, W., Zhang, Z., Zhang, J., Xu, S., Li, M., Li, X., Chen, Z., Wang, C. Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies. J. Vis. Exp. (192), e65125, doi:10.3791/65125 (2023).

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