이 프로토콜은 일차 마우스 및 인간 조직에서 유래한 눈물샘 오가노이드를 확립, 유지, 유전적으로 변형, 분화, 기능적으로 특성화 및 이식하는 방법을 설명합니다.
눈물샘은 안구 표면 항상성에 필수적인 기관입니다. 눈물막의 수성 부분을 생성함으로써 건조 스트레스와 외부 손상으로부터 눈을 보호합니다. 적절한 시험관 내 모델이 없기 때문에 눈물샘(병리) 생리학에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 오가노이드 기술은 여러 장기에 유용한 실험 플랫폼으로 입증되었습니다. 여기에서 우리는 눈물샘 생검에서 시작하여 마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드를 확립하고 유지하기 위한 프로토콜을 공유합니다. 배양 조건을 수정하여 눈물샘 오가노이드 기능을 향상시킵니다. 오가노이드 기능은 눈물샘 오가노이드를 선택된 신경 전달 물질에 노출시켜 내강에서 눈물 방출을 유발하는 “울음” 분석을 통해 조사할 수 있습니다. 이 현상을 이미지화하고 정량화하는 방법을 설명합니다. 눈물샘 항상성에서 관심 유전자의 역할을 조사하기 위해 유전자 변형이 가능합니다. 우리는 가이드 RNA 설계에서 오가노이드 클론 유전형 분석에 이르기까지 기본 편집기를 사용하여 눈물샘 오가노이드를 유전적으로 변형하는 방법을 철저히 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스에 동소 이식을 통해 인간 눈물샘 오가노이드의 재생 가능성을 조사하는 방법을 보여줍니다. 이 포괄적인 도구 세트는 마우스와 인간 눈물샘 오가노이드를 사용하여 눈물샘(병리) 생리학을 연구할 수 있는 리소스를 제공합니다.
눈물샘은 눈물막1의 수성층의 대부분을 생성하는 선 상피이다. 눈물막의 수층에는 안구 표면을 윤활하는 물뿐만 아니라 감염으로부터 안구 표면을 보호하는 다양한 항균 성분이 포함되어 있다2. 눈물샘이 손상되거나 염증이 생기면 안구건조증이 발생하여 환자에게 불편함을 주고 결국 시력 상실로 이어질 수 있다3. 수년에 걸쳐, 눈물샘, 특히 인간의 샘을 연구하는 모델 시스템은 제한적이었다 4,5,6. 이것은 생리학적 및 병리학적 조건에서 눈물샘 기능에 관한 지식 격차에 기여했습니다.
최근에, 시험관 내 모델은 접시 7,8,9에서 눈물샘을 연구하기 위해 개발되었다. 이 눈물샘 오가노이드는 세포외 기질에서 3차원 구조로 성장한 성체 줄기 세포에서 유래하며, 시험관 내에서 재생 능력을 유지하는 성장 인자 칵테일이 보충됩니다 7. 성체줄기세포(ASC) 유래 오가노이드의 장점은 건강한 조직 특징을 재현하면서 매우 오랫동안 유지될 수 있다는 것입니다. 이러한 유형의 오가노이드는 예를 들어 기질 세포를 포함할 수 있는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 오가노이드와 달리 상피 세포로만 구성됩니다. 만능줄기세포(PSC) 유래 오가노이드와 달리 ASC 오가노이드는 성체 조직에서 직접 형성되며 확장하기 위해 유전자 변형이 필요하지 않습니다. ASC 오가노이드는 성인의 특성을 나타낸다10.
이 프로토콜에는 마우스 및 인간 일차 조직에서 눈물샘 오가노이드를 추출하기 위한 도구 상자가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 간단한 성장 인자 회수를 통해 오가노이드의 기능을 더욱 향상시키는 방법과 팽창 분석을 수행하여 오가노이드가 누액을 분비하도록 자극하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에는 CRISPR 유래 염기 편집기를 사용하여 마우스 오가노이드를 유전적으로 조작하기 위한 전기천공 기반 형질주입 방법이 추가로 포함되어 있습니다. 기존의 Cas9와 달리 염기 편집기를 사용하면 이중 가닥 절단을 생성하지 않고 게놈의 단일 염기를 수정할 수 있습니다11,12. 마지막으로, 인간 눈물샘 오가노이드를 면역결핍 마우스에 이식하고 생착에 대한 후속 조직학적 평가를 설명합니다. 이 눈물샘 오가노이드 툴킷은 눈물샘 재생 및 기능에 대한 연구와 유전 및 염증성 질환 모델링에 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 기능 분석, 돌연변이 모델링 및 이식을 위한 눈물샘 오가노이드의 설정 및 사용을 설명합니다. 마우스와 인간 눈물샘 오가노이드를 확립할 때 조직 해리가 중요합니다. 조직이 충분히 소화되지 않으면 오가노이드 수율이 낮아집니다. 조직이 과도하게 소화되면 세포가 죽고 오가노이드로 자라지 않습니다. 각 조직은 최적의 오가노이드 성장을 보장하기 위해 특정 시간 동안 특정 효소로 소화되어야 합니다14,17,18. 눈물샘은 피펫팅 기반의 기계적 해리와 결합된 5-10분의 콜라게나제 소화가 작은 조직 조각을 분리하기에 충분한 다소 부드러운 조직입니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 응용 분야를 위해 단일 세포를 얻어야 하는 경우, 단일 세포 단계에 도달할 때까지 해리를 더 오래 수행할 수 있지만, 생존력 감소를 제한하기 위해 단일 세포를 얻는 즉시 해리를 중지해야 합니다. 조직 해리가 매우 중요하기 때문에 과소화는 눈물샘 오가노이드 형성 실패의 가장 큰 원인입니다.
눈물샘 오가노이드의 적절한 유지는 사용에 중요합니다. 장기 유지는 유도만능줄기세포 유래 오가노이드와 비교하여 성체줄기세포 유래 눈물샘 오가노이드의 특징입니다 7,17. 장기적인 유지 관리를 위해서는 정기적인 오가노이드 분할 및 중간 교체를 수행해야 합니다. 이것이 없으면 오가노이드는 분화하기 시작하고 줄기 세포 잠재력이 감소하여 장기적인 유지를 방해합니다7. 이 단계에서 다시 말하지만, 과소화는 줄기 세포를 죽이고 오가노이드 유지를 손상시킬 수 있습니다. 정기적인 유지 관리를 위해 단일 세포로의 오가노이드 해리가 필요하지 않습니다. 그러나 클론 녹아웃 오가노이드 라인을 생성하려면 단일 세포로 시작하는 것이 중요합니다. 그렇지 않은 경우 오가노이드는 서로 다른 유전적 배경을 가진 세포의 모자이크로 구성되어 정의된 단일 돌연변이의 효과를 분석하는 것이 불가능합니다. 여기에서는 정지 코돈을 생성하기 위해 C > T 베이스 편집기를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 게놈 편집기는 NGG PAM의 12-18개 염기 내에서 아르기닌, 글루타민 또는 트립토판 코돈의 존재에 의존합니다. gRNA 설계에서 이러한 조건이 충족되지 않는 경우, 대체 PAM이 있는 기존 Cas9 또는 C>T base editor를 사용할 수 있습니다 7,18. 그러나 기존의 Cas9는 수리 시 인델을 초래하는 이중 가닥 파손을 도입합니다(11). 두 대립 유전자 모두 서로 다른 인델을 가질 수 있으므로 클론 유전형 분석에는 추가적인 주의가 필요합니다. 도입된 변형의 디콘볼루션은 두 대립 유전자 모두 프레임 밖 인델을 포함하도록 수행되어야 하며, 따라서 오가노이드 클론이 표적 유전자에 대해 녹아웃되도록 해야 합니다19. C > T 염기 편집기의 장점은 반드시 정지 코돈을 초래하지 않는 점 돌연변이를 모델링하는 데 사용할 수 있다는 사실에 있습니다. 예를 들어, 홍채증 환자에서 발견되는 특정 Pax6 돌연변이를 모델링하여 눈물샘 생리학에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있다20.
눈물샘은 눈물막1의 수성 부분을 분비합니다. 눈물 분비는 성장 인자 철회 및 NOTCH 억제에 의해 매개되는 분화 후 인간 오가노이드에서 요약될 수 있습니다. 이러한 조건에서 오가노이드는 말단 분화를 거쳐 더 이상 유지될 수 없습니다. 그러나 차별화된 눈물샘 오가노이드는 잠재적으로 고처리량 스크리닝에서 안구 건조증의 맥락에서 눈물을 유발하는 약물의 개발을 안내할 수 있습니다. 이 프로토콜에 제시된 찢어짐 분석은 현재 짧은 시간 내에 오가노이드 크기의 가장 큰 변화를 제공하는 분석법으로, 약물 스크리닝 7,9,17의 맥락에서 더 쉽게 정량화할 수 있습니다.
줄기세포 치료는 안구건조증에서 눈물샘 재생에 큰 가능성을 가지고 있다21. 성체 줄기 세포 유래 눈물샘 오가노이드는 이러한 응용 분야의 원료가 될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 대부분 낭종으로 인간 눈물샘 오가노이드 생착을 초래합니다. 낮은 오가노이드 생착은 잘못된 부위에 오가노이드가 주입되어 발생할 수 있습니다. 염료로 주입 절차를 훈련하면 주입 부위를 추적할 수 있으며 궁극적으로 주입 정확도가 향상됩니다. 대안적으로, 마우스 표피는22세 이전의 쥐에서와 같이 눈물샘에 직접 접근할 수 있도록 절개될 수 있다. 이 방법은 시간이 더 오래 걸리지만 더 정확할 수 있습니다. 반면에, 본 프로토콜에서는 오가노이드가 마우스 눈물샘에 기능적으로 통합되지 않았습니다. iPSC 유래 눈물샘 생착에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다22. 이식 방법은 눈물샘을 미리 상처를 입히거나, 안구건조증 마우스 모델을 사용하거나, 오가노이드를 단세포 또는 작은 덩어리로 주입함으로써 더욱 개선될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 성체 줄기 세포 유래 눈물샘 오가노이드 및 관련 툴킷은 눈물샘 연구 및 재생 의학에서 향후 응용 분야의 기초가 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
프로토콜의 초기 개발에 대해 Yorick Post에 감사드립니다. 이 연구는 Cancer Research UK Grand Challenge(C6307/A29058)와 Mark Foundation for Cancer Research에서 SPECIFICANCER 팀에 수여하는 상으로 부분적으로 지원되었습니다.
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C |
5x green GoTaq Flexi buffer | Promega | M891A | Store at -20 °C |
A83-01 | Tocris | 2939 | Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | store at 4 °C |
Agar plates containing Ampicillin | Hubrecht Institute | ||
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Autoclave VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | ||
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | Store at -20 °C, 50x |
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL | BD Bioscience | 324825 | |
Benchtop microscope DMI1 | Leica | ||
Bovine serum albumine (BSA) | MP biomedicals | 160069 | Store at 4 °C |
BTXpress | BTX | MDS450805 | |
C57BL/6 mice | Hubrecht Institute | ||
Cassettes | Klinipath | 410-02S | |
CellBanker 1 | amsbio | 11910 | Cryopreservation medium, adhere to instructions |
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid monohydrate | J.T. Baker | 0088 | CAS: 5949-29-1 |
Collagenase I | Sigma Aldrich | C9407 | Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Conical tubes 50 mL | Corning | CLS430828-500EA | |
Coverslips 24 mm x 50 mm | Menzel-Gläzer | BB024050S1 | |
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 – extracellular matrix | R&D Systems, Bio-Techne | 3533-001-02 | Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month |
DAPT | Sigma Aldrich | D5942 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
Disodium hydrogen phosphate anhydrous | VWR chemicals | 28026.292 | CAS: 7558-79-4 |
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | CAS:10028-24-7 |
Dispase | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x |
Disposable Scalpel Sterile N° 10 | Swann Morton | 3033838 | |
DM4000 microscope | Leica | ||
dNTPs 25 mM | Promega | U1420 | Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C |
Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
Easy strainers 70 µm | Greiner | 542170 | |
Electroporation cuvette | Nepagene | EC002S | |
EnVision+/HRP mouse | Agilent | K400111-2 | |
Ethanol 100% | BOOM | 84045206;5000 | CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions |
Ethanol 70% | BOOM | 84010059.5000 | CAUTION |
Ethanol 96% | BOOM | 84050065.5000 | CAUTION |
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | Live-imaging brightfield microscrope | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x |
Fiji | NIH, Fiji developers | ||
Formaldehyde solution 4% | Sigma-Aldrich | 1.00496 | CAS: 50-00-0, CAUTION |
Forskolin | Tocris | 1099 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100x |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Store at -20 °C |
Haematoxylin | VWR chemicals | 10047105 | Store at room temperature |
HEPES | Gibco | 15630-080 | Store at 4 °C, 100x |
Histocore H and C, Tissue embedding machine | Leica | ||
Hot plate | Meidax | ||
Human nucleolar antigen antibody | Abcam | ab-190710 | |
Hydrochloric acid 5 N | ThermoFisher Scientific | 10605882 | CAS: 7647-01-0, CAUTION |
Hydrogen peroxyde 30% | Chem-lab | CL00.2308.1000 | CAS: 7722-84-1, CAUTION |
Hygromycin B-gold | InvivoGen | ant-hg | Stock at 100 mg/µL, 1000x |
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
IsoFlo 100% | Mecan | 5960501 | |
LB medium | Hubrecht Institute | ||
MgCl2 25 mM | Promega | A351H | Store at -20 °C |
Microtome RM2235 | Leica | ||
Midiprep DNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | K210005 | |
Miniprep DNA isolation kit | ThermoFisher scientific | K210003 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x |
NEPA21 electroporator | Nepagene | ||
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Store at -20 °C, stock at 1M, 100x |
NOD Scid Gamma (NSG) mice | Hubrecht Institute colony | ||
Noggin conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
Noradrenaline | Sigma Aldrich | A7257 | Store at -20 °C, stock at 100 mM |
Oven | Memmert | Set at 58 °C | |
P20, P200 and P1000 pipettes | Gilson | ||
Paraffin | VWR chemicals | 10048502 | |
Pasteur pipettes, glass plugged | ThermoFisher Scientific | 1150-6973 | |
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG | IDT | ||
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC | IDT | ||
pCMV_ABEmax_P2A_GFP | Addgene | 112101 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Store at -20 °C |
Pertex | Klinipath | AM-08010 | |
pFYF1320 | Addgene | 47511 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1000X, store at -20 °C |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Petri dish, 10 cm | Greiner | 633102 | |
Q5 buffer | New England Biolabs | B9027S | |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | Store aliquots at -20 °C |
R-spondin 3 conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | IDT | ||
Slides | StarFrost | MBB-0302-55A | Adhesive, ground |
Sodium azide | Merck | 8.22335.1000 | CAS: 26628-22-8, CAUTION |
Sodium cytrate dihydrate | J.T. Baker | 0280 | CAS: 6132-04-3 |
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC |
IDT | ||
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha | Invitrogen | 18265-017 | |
Suspension cell culture plates (24-well) | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Suspension cell culture plates (12-well) | Greiner Bio-One | 665102 | 12-well |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
TAE buffer | ThermoFisher Scientific | B49 | Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water |
Transposase-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
TrypLE Express Enzyme | Invitrogen | 12605-028 | store at 4 °C |
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT | IDT | ||
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550 | |
Water bath | Tulabo | ||
Xylene | Klinipath | 4055-9005 | CAS: 1330-20-7, CAUTION |
Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |