链脲佐菌素诱导的雄性SD大鼠糖尿病伤口模型是目前研究I型糖尿病伤口愈合的最广泛使用的模型。此协议描述了用于构建此模型的方法。它还提出并解决了潜在的挑战,并检查了糖尿病伤口的进展和血管生成特征。
单次高剂量链脲佐菌素注射,然后在大鼠背部进行全层皮肤切除是构建1型糖尿病伤口动物模型的常用方法。然而,操作不当会导致大鼠模型不稳定和高死亡率。不幸的是,关于1型糖尿病伤口建模的现有指南很少,而且缺乏细节,也没有提供具体的参考策略。因此,该协议详细介绍了构建1型糖尿病伤口模型的完整程序,并分析了糖尿病伤口的进展和血管生成特征。1型糖尿病伤口建模涉及以下步骤:链脲佐菌素注射液的制备,1型糖尿病的诱导以及伤口模型的构建。在损伤后第7天和第14天测量伤口面积,提取大鼠皮肤组织进行组织病理学和免疫荧光分析。结果显示,55 mg/kg链脲佐菌素诱发的1型糖尿病与较低的死亡率和高成功率有关。诱导5周后血糖水平相对稳定。第7天和第14天糖尿病创面愈合率显著低于正常创面(p < 0.05),但第14天均能达到90%以上。与正常组相比,第14天糖尿病创面表皮层闭合不完全,上皮再形成延迟,血管生成显著降低(p < 0.01)。基于该方案构建的1型糖尿病伤口模型具有慢性伤口愈合的特点,包括与正常大鼠伤口相比,闭合不良,上皮再化延迟和血管生成减少。
1型糖尿病(T1DM)是一种慢性代谢性疾病,其特征是高血糖和胰腺β细胞破坏1。T1DM伤口是一种慢性不愈合的伤口,也是人类糖尿病最常见和最具破坏性的并发症2,3。动物模型是研究伤口愈合过程中的病理变化以及潜在治疗剂的安全性和有效性的最合适原型4。与其他类型相比,雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠对链脲佐菌素(STZ)更敏感,并且表现出较低的相关死亡率,使它们在糖尿病伤口研究中很受欢迎5,6。
已经描述了许多构建T1DM伤口模型的方法。关于T1DM模型,研究主要集中在STZ注射方法对糖尿病诱导成功率的影响7,8。但是,建模过程受到同一步骤不一致操作的影响。在一项研究中,大鼠在注射STZ之前禁食18小时;注射STZ后1周血糖水平高于16.67 mmol/L的大鼠被认为是糖尿病,3周后引入糖尿病伤口9。相反,在相关研究中,Zhu等人在STZ注射前禁食大鼠12 h;注射后72 h血糖水平高于16.7 mmol/L的大鼠被认为是糖尿病,4周后10引入糖尿病伤口。总体而言,STZ注射方案,糖尿病诊断标准和伤口引入时间不一致。
在伤口建模方面,在大多数研究中,在成功诱导糖尿病后切除背侧皮肤的全厚度以构建T1DM伤口11,12,13。虽然该模型易患大鼠皮肤挛缩,但它是伤口愈合研究中最常用的模型,因为它劳动强度低且价格便宜14,15.然而,缺乏对这种全层切除技术的方法指导研究。此外,现有研究中没有关于伤口大小和位置的统一标准12,16。伤口的大小和位置可以间接影响实验设计的一致性和结果的科学有效性。因此,迫切需要一个T1DM诱导和伤口建模的标准协议作为研究人员的参考。本研究的目的是可视化T1DM伤口建模的特定方案,可用作T1DM伤口研究的参考。
该协议阐明了T1DM伤口建模中存在争议的操作。这项工作解决了对STZ注射方案,T1DM诱导成功标准,血糖稳定时间以及伤口位置和大小的关注。此外,还阐明了T1DM伤口愈合评估的病理特征和可测量参数。
大鼠在STZ注射前禁食18小时,以避免葡萄糖或其类似物与β细胞的竞争性结合,这可能会影响STZ的功效。诱导T1DM最常用的方法是单次高剂量的STZ,它通过破坏胰岛和减少胰岛素分泌来增加血糖21。实验前试验表明,高成功率和低死亡率的最佳STZ剂量为55mg / kg,低于先前研究中报告的最佳剂量22,23,24。在该方案中,使用55mg / kg STZ的单次腹膜内注射诱导T1DM。
注射STZ后3天血糖水平均高于16.7 mmol/L。然而,STZ注射后第7天的血糖水平高于16.7 mmol/L是成功T1DM建模的推荐标准,因为胰岛损伤的程度因大鼠而异,适当延长诊断时间可以降低假阴性率。此外,STZ注射后5周血糖波动稳定,在此期间大鼠体重逐渐增加,与先前的发现一致25,26。这表明T1DM模型中的血糖水平应稳定至少6周,并且6周后大鼠体重的增加降低了伤口建模期间的死亡率。因此,该协议在STZ注射后8周进行了伤口建模。
糖尿病患者在伤口后第7天和第14天的伤口闭合率明显低于正常伤口组,表明愈合缓慢。此外,糖尿病患者的伤口再上皮化和血管生成明显低于正常组。这表明T1DM伤口模型的伤口愈合和再上皮化延迟比正常大鼠慢,这可能与伤口血管生成减少的病理变化有关。然而,在第14天,T1DM伤口愈合率也在90%以上,这与人类糖尿病伤口的慢性不愈合特征不同。这可能是因为啮齿动物伤口愈合的生理机制与人类不同27。因此,最佳伤口直径至少为20毫米,足以让时间评估干预措施在糖尿病伤口研究中的疗效。伤口位置应避开肩胛骨和脊柱,因为这两个部位的连续运动可能会破坏伤口愈合。
总之,使用该方案的方法构建T1DM伤口模型是有效的。该方案复制了慢性糖尿病伤口的一些特征,例如与正常大鼠伤口相比,伤口愈合较慢,再上皮化延迟以及血管生成减少。然而,尚不清楚该模型是否可以复制糖尿病伤口的其他慢性表型。此外,该协议描述了最基本和广泛使用的方法,该方法不考虑大鼠皮肤收缩的问题。未来的研究可以将伤口夹板的使用纳入该协议或探索慢性糖尿病伤口的其他模型,这将是未来研究人员面临的重大挑战。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了中国国家自然科学基金(82104877)的资助。
Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
Image J software | National Institutes of Health | — | |
Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
Streptozotocin | Sigma | 57654595 |