In deze studie wordt een reeks methoden gepresenteerd om DESI-MSI-monsters van fabrieken voor te bereiden, en een procedure voor DESI-assemblage-installatie, MSI-gegevensverzameling en -verwerking wordt in detail beschreven. Dit protocol kan in verschillende omstandigheden worden toegepast voor het verkrijgen van ruimtelijke metaboloominformatie in planten.
Het medicinale gebruik van de traditionele Chinese geneeskunde is voornamelijk te wijten aan de secundaire metabolieten. Visualisatie van de verdeling van deze metabolieten is een cruciaal onderwerp geworden in de plantenwetenschap. Beeldvorming met massaspectrometrie kan enorme hoeveelheden gegevens extraheren en ruimtelijke verdelingsinformatie hierover bieden door weefselplakken te analyseren. Met het voordeel van een hoge doorvoer en hogere nauwkeurigheid, wordt desorptie-elektrospray ionisatie massaspectrometrie beeldvorming (DESI-MSI) vaak gebruikt in biologisch onderzoek en in de studie van de traditionele Chinese geneeskunde. De procedures die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn echter ingewikkeld en niet betaalbaar. In deze studie hebben we sectie- en DESI-beeldvormingsprocedures geoptimaliseerd en een meer kosteneffectieve methode ontwikkeld om de distributie van metabolieten te identificeren en deze verbindingen in plantenweefsels te categoriseren, met een speciale focus op traditionele Chinese geneesmiddelen. De studie zal het gebruik van DESI in metabolietanalyse en standaardisatie van traditionele Chinese geneeskunde / etnische geneeskunde voor onderzoeksgerelateerde technologieën bevorderen.
Visualisatie van metabolietverdeling is een cruciaal onderwerp geworden in de plantenwetenschap, vooral in de traditionele Chinese geneeskunde, omdat het het vormingsproces van specifieke metabolieten in de plant onthult. Met betrekking tot de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) geeft het informatie over de actieve componenten en begeleidt het de toepassing van plantendelen in farmaceutische toepassingen. Normaal gesproken wordt visualisatie van metabolieten bereikt door in situ hybridisatie, fluorescentiemicroscopie of immunohistochemie, maar het aantal verbindingen dat door deze experimenten wordt gedetecteerd, brengt beperkte chemische informatie over. In combinatie met weefselkleuring kan massaspectrometriebeeldvorming (MSI) grote hoeveelheden gegevens leveren en ruimtelijke distributie-informatie van verbindingen leveren door weefselplakken op micronniveau1 te scannen en te analyseren. MSI gebruikt analyten voor desorptie en ionisatie van het monsteroppervlak, gevolgd door massaanalyse van de resulterende dampfase-ionen en toepassing van beeldvormingssoftware om de informatie te integreren en een tweedimensionaal beeld te plotten dat een specifieke ionenrijkdom registreert. Deze technologie kan zowel exogene als endogene moleculen bepalen door de karakteristieke verdeling van geneesmiddelen en hun geïnduceerde metabolieten in doelweefsels en organente detecteren 2,3,4,5.
De afgelopen decennia zijn verschillende modaliteiten voor beeldvorming van MS ontwikkeld; de meest prominente onder hen zijn desorptie-elektrospray ionisatie-gebaseerde MSI (DESI-MSI), matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) en secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS)6. DESI-MSI wordt vaak gebruikt in biologisch onderzoek vanwege de atmosferische werking, hoge doorvoer en hogere nauwkeurigheid7. MALDI is toegepast om een transthyretinefragment te identificeren als een potentiële nefrotoxische biomarker voor gentamicine en om de verdeling van de neurotoxische metaboliet 1-methyl-4-fenylpyridinium te analyseren na de behandeling van 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine in muizenhersenen 8,9. MALDI en DESI zijn gebruikt om de samenstelling van geneesmiddel-geïnduceerde kristalachtige structuren in de nier van gedoseerde konijnen te bepalen; Deze structuren zijn voornamelijk samengesteld uit metabolieten gevormd door de demethylering en / of oxidatie van het geneesmiddel10. Bovendien is MSI toegepast bij de lokalisatie van metabole distributie van geneesmiddeltoxiciteit in doelorganen. De cellen in plantenweefsel variëren echter en verschillen van dieren en vereisen speciale sectieprocedures.
In planten, met behulp van MALDI-beeldvorming, is tot nu toe de verdeling van verschillende verbindingen in tarwe (Triticum aestivum) stengel, sojabonen (Glycine max), rijst (Oryza sativa) zaden, Arabidopsis thaliana bloemen en wortels, en gerst (Hordeum vulgare) zaden geanalyseerd 11,12,13,14,15,16,17,18 . Recente studies hebben gemeld dat DESI-MSI opkomt in de metabolietanalyse van natuurlijke geneesmiddelen en producten, vooral in TCM’s zoals Ginkgo biloba, Fuzi en Artemisia annua L 19,20,21. In deze studies verschillen de protocollen voor de bereiding van monsters van plantaardig materiaal en sommige vereisen complexere apparatuur, zoals een vriesmicrotoom. DESI-MSI stelt strenge eisen aan de vlakheid van het gedetecteerde monster. Bij het analyseren van het orgaan of weefsel van een dier wordt het monster meestal gemaakt door cryo-sectie22. De procedure voor cryo-sectie is echter ingewikkeld en duurder, en de veelgebruikte lijm optimale snijtemperatuur (OCT) -methode heeft een sterk signaal bij het beeldvormen. Bovendien variëren de medicinale weefsels van TCM; bijvoorbeeld, de wortel van Salvia miltiorrhiza, bekend als Danshen in het Chinees, wordt medicinaal gebruikt, terwijl in Zisu (Perilla frutescens), het blad wordt gebruikt23,24. Daarom is het noodzakelijk om de monstervoorbereidingsprocedures te verbeteren om het gebruik van DESI bij metabolietanalyse voor TCM te bevorderen.
Als een overblijvend kruid en een veelgebruikte TCM, werd S. miltiorrhiza aanvankelijk opgenomen in de oudste medicijnmonografie, Shennong’s Classic of Materia Medica (bekend als Shennong Bencao Jing in het Chinees). In deze studie hebben we sectie- en DESI-beeldvormingsprocedures geoptimaliseerd en een meer kosteneffectieve methode ontwikkeld om de distributie te identificeren en de verbindingen in weefsels van S. miltiorrhiza te categoriseren. Deze methode kan ook de nadelen van droge weefsels overwinnen – dat ze meestal gemakkelijk breken onder de stikstofslag – en de ontwikkeling van TCM bevorderen. De studie zal de standaardisatie van TCM / etnische geneeskunde voor onderzoeksgerelateerde technologieën bevorderen.
De opkomst van MS-technologie heeft de afgelopen jaren een nieuw inzicht geopend in het onderzoek naar natuurlijke producten op moleculair niveau24. Het MS-instrument, met zijn hoge gevoeligheid en hoge doorvoer, maakt gerichte en ongerichte analyse van metabolieten in natuurlijke producten mogelijk, zelfs met sporenconcentratie25. Daarom wordt MS momenteel veel gebruikt op het gebied van traditionele Chinese geneeskunde (TCM) chemie. Het kwalitatieve en kwantitatieve onder…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation van de provincie Sichuan (nr. 2022NSFSC0171) en het Xinglin Talent Program van Chengdu University of TCM (nr. 030058042).
2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |