Summary

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

De methodologie beschrijft de generatie van van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen (MoDC’s) en hun toepassing voor de in vitro evaluatie van antigene kandidaten tijdens de ontwikkeling van potentiële veterinaire vaccins bij runderen.

Abstract

Dendritische cellen (DC’s) zijn de krachtigste antigeen-presenterende cellen (APC’s) binnen het immuunsysteem. Ze patrouilleren in het organisme op zoek naar ziekteverwekkers en spelen een unieke rol binnen het immuunsysteem door de aangeboren en adaptieve immuunresponsen te koppelen. Deze cellen kunnen fagocytiseren en vervolgens gevangen antigenen presenteren aan effector-immuuncellen, waardoor een breed scala aan immuunresponsen wordt geactiveerd. Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van van runderen monocyten-afgeleide dendritische cellen (MoDC’s) geïsoleerd uit perifere bloedmononucleaire cellen van runderen (PBMC’s) en hun toepassing bij het evalueren van vaccinimmunogeniciteit.

Magnetische celsortering werd gebruikt om CD14+ monocyten uit PBMC’s te isoleren, en de suppletie van compleet kweekmedium met interleukine (IL)-4 en granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) werd gebruikt om de differentiatie van CD14+ monocyten in naïeve MoDC’s te induceren. De generatie van onrijpe MoDC’s werd bevestigd door het detecteren van de expressie van belangrijke histocompatibiliteitscomplex II (MHC II), CD86 en CD40 celoppervlakmarkers. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin werd gebruikt om de onrijpe MoDC’s te pulseren, die vervolgens samen met naïeve lymfocyten werden gekweekt.

De flowcytometrie-analyse van de antigeen-gepulseerde MoDC’s en lymfocytenco-cultuur onthulde de stimulatie van T-lymfocytenproliferatie door de expressie van Ki-67-, CD25-, CD4- en CD8-markers. De analyse van de mRNA-expressie van IFN-γ en Ki-67, met behulp van kwantitatieve PCR, toonde aan dat de MoDC’s de antigeenspecifieke priming van lymfocyten in dit in vitro co-cultuursysteem konden induceren. Bovendien toonde IFN-γ secretie beoordeeld met behulp van ELISA een significant hogere titer (**p < 0,01) in de rabiësvaccin-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur dan in de niet-antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur. Deze resultaten tonen de validiteit van deze in vitro MoDC-test om vaccinimmunogeniciteit te meten, wat betekent dat deze test kan worden gebruikt om potentiële vaccinkandidaten voor runderen te identificeren voordat wordt overgegaan tot in vivo onderzoeken, evenals in vaccinimmunogeniciteitsbeoordelingen van commerciële vaccins.

Introduction

Veterinaire vaccinatie is een cruciaal aspect van de veehouderij en gezondheid, omdat het bijdraagt aan het verbeteren van de voedselzekerheid en het dierenwelzijn door bescherming te bieden tegen ziekten die de veehouderij wereldwijd treffen1. Een effectieve in vitro methode om de immunogeniciteit van mogelijke vaccinkandidaten te beoordelen, zou het proces van vaccinontwikkeling en -productie helpen versnellen. Het is daarom noodzakelijk om het veld van immuuntesten uit te breiden met innovatieve methodologieën op basis van in vitro studies, omdat dit zou helpen om de complexiteit van de immuunprocessen met betrekking tot immunisatie en pathogene infectie te onthullen. Momenteel worden in vivo immunisatie- en challengestudies bij dieren, die periodieke bemonstering vereisen (bijv. Bloed en milt), gebruikt om de immunogeniciteit van kandidaat-vaccins en adjuvantia te meten. Deze testen zijn duur, tijdrovend en hebben ethische implicaties, omdat in de meeste gevallen euthanasie bij dieren wordt uitgevoerd aan het einde van de proeven.

Als alternatief voor in vivo assays zijn perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) gebruikt om vaccin-geïnduceerde immuunresponsen in vitrote evalueren 2. PBMC’s zijn een heterogene populatie van cellen die bestaat uit 70% -90% lymfocyten, 10% -20% monocyten en een beperkt aantal dendritische cellen (DC’s, 1% -2%)3. PBMC’s herbergen antigeen-presenterende cellen (APC’s) zoals B-cellen, monocyten en DC’s, die voortdurend patrouilleren in het organisme op zoek naar tekenen van infectie of weefselbeschadiging. Lokaal uitgescheiden chemokines vergemakkelijken de rekrutering en activering van APC’s naar deze plaatsen door zich te binden aan celoppervlakreceptoren. In het geval van monocyten richten chemokines hun lot om te differentiëren in DC’s of macrofagen4. Zodra DC’s een pathogeen tegenkomen en vangen, migreren ze naar secundaire lymfoïde organen, waar ze de verwerkte pathogene peptide-antigenen kunnen presenteren met behulp van major histocompatibility complex (MHC) klasse I of klasse II oppervlakte-eiwitten aan respectievelijk CD8 + T-cellen of CD4 + T-cellen, waardoor een immuunrespons 5,6 wordt geactiveerd.

De sleutelrol die DC’s spelen bij het orkestreren van een beschermende immuunrespons tegen verschillende pathogenen maakt ze een interessant onderzoeksdoel voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, vooral bij het ontwerpen van vaccins en adjuvantia tegen infectieuze agentia7. Aangezien de fractie van DC’s die kan worden verkregen uit PBMC’s vrij klein is (1%-2%), zijn monocyten in plaats daarvan gebruikt om DC’s in vitro8 te genereren. Deze van monocyten afgeleide DC’s (MoDC’s) werden aanvankelijk ontwikkeld als een mogelijke behandelingsstrategie in kankerimmunotherapie9. Meer recent zijn MoDC’s gebruikt voor vaccinonderzoek 10,11,12, en klassieke monocyten zijn het overheersende subtype (89%) voor MoDC-productie 13. De productie van MoDC’s in vitro is eerder bereikt door de toevoeging van granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) gegeven in combinatie met andere cytokines zoals interleukine-4 (IL-4), tumornecrosefactor α (TNF-α) of IL-1314,15,16.

Het succes van een in vitro MoDC-test is afhankelijk van het vermogen van antigeen-gestimuleerde volwassen MoDC’s om de omvang en het type van de immuunrespons te moduleren die specifiek zijn voor het type antigeen dat is gedetecteerd17. Het type pathogeen dat door MoDC’s wordt herkend en gepresenteerd, bepaalt de differentiatie van CD4 + T-helper (Th) -cellen in Th1-, Th2- of Th17-effectorcellen en wordt gekenmerkt door een pathogeenspecifiek secretoir cytokineprofiel. Een Th1-respons wordt opgewekt tegen intracellulaire pathogenen en resulteert in de secretie van interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor bèta (TNF-β), die fagocytisch-afhankelijke bescherming moduleert. Een Th2-respons wordt geactiveerd tegen parasitaire organismen en wordt gekenmerkt door IL-4, IL-5, IL-10 en IL-13-secretie, die fagocytisch-onafhankelijke humorale bescherming initieert. Th17 biedt neutrofielafhankelijke bescherming tegen extracellulaire bacteriële en schimmelinfecties gemedieerd door de secretie van IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 en TNF-α 18,19,20,21. Op basis van eerdere studies is opgemerkt dat niet alle pathogenen binnen het verwachte cytokineprofiel vallen. Dermale MoDC’s stimuleren bijvoorbeeld, als reactie op leishmania parasitaire infectie, IFN-γ secretie van CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen, waardoor een beschermende pro-inflammatoire Th1-respons wordt geïnduceerd22.

Het is ook aangetoond dat MoDC’s bij kippen die zijn geprimed met Salmonella lipopolysaccharide (LPS), een variabele respons tegen Salmonella typhimurium kunnen induceren door zowel Th1- als Th2-responsen te activeren, terwijl Salmonella gallinarum alleen een Th2-respons induceert, wat de hogere weerstand van de laatste tegen MoDC-klaring23 zou kunnen verklaren. De activering van MoDC’s tegen Brucella canis (B. canis) is ook gemeld in zowel honden- als menselijke MoDC’s, wat betekent dat dit een zoönotisch infectiemechanisme kan vertegenwoordigen24. Menselijke MoDC’s geprimed met B. canis induceren een sterke Th1-respons die weerstand biedt tegen ernstige infectie, terwijl Canine MoDC’s een dominante Th17-respons induceren met een verminderde Th1-respons, wat vervolgens leidt tot de oprichting van chronische infectie25. Runder-MoDC’s vertonen een verhoogde affiniteit voor mond- en klauwzeervirus (FMDV) geconjugeerd met immunoglobuline G (IgG) in vergelijking met niet-geconjugeerde FMDV alleen, aangezien de MoDC’s een viraal antilichaamcomplex vormen als reactie op de eerste10. Samen laten deze studies zien hoe MoDC’s zijn gebruikt om de complexiteit van immuunresponsen tijdens pathogene infectie te analyseren. De adaptieve immuunresponsen kunnen worden geëvalueerd door de kwantificering van specifieke markers geassocieerd met lymfocytenproliferatie. Ki-67, een intracellulair eiwit dat alleen in delende cellen wordt gedetecteerd, wordt beschouwd als een betrouwbare marker voor proliferatiestudies26, en evenzo komt CD25 uitgedrukt op het oppervlak van T-cellen tijdens de late fase van activering overeen met lymfocytenproliferatie27,28.

Deze studie toont een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van runder-MoDC’s, gevolgd door hun toepassing in een in vitro immuuntest die wordt gebruikt voor het testen van de immunogeniciteit van vaccins. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin (RV) werd gebruikt om de werkzaamheid van deze test te valideren. T-lymfocytenactivatie en -proliferatie werden gemeten door flowcytometrie, real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) door de analyse van gevestigde celactivatiemarkers zoals Ki-67 en CD25 en de secretie van IFN-γ 28,29,30,31. Er worden geen dier- of menselijke experimentele proeven uitgevoerd tijdens de MoDC-test.

Protocol

Bloedafname wordt uitgevoerd door een gecertificeerde dierenarts in overeenstemming met de ethische richtlijnen van het Oostenrijkse Agentschap voor Gezondheid en Voedselveiligheid (AGES) en in overeenstemming met de geaccepteerde dierenwelzijnsnormen32. De studie kreeg ethische goedkeuring van het Oostenrijkse ministerie van Landbouw. Het experimentele ontwerp voor het genereren van MoDC’s en de daaropvolgende toepassing ervan wordt geïllustreerd in figuur 1. <p…

Representative Results

Deze methodologie beschrijft de in vitro generatie van runder-MoDC’s voor de evaluatie van kandidaat-vaccinantigenen voorafgaand aan het uitvoeren van in vivo studies. Figuur 1 illustreert het experimentele schema van de productie van MoDC’s bij runderen en de toepassing van de MoDC’s voor de in vitro test. Met behulp van de magnetische celsorteertechniek was het mogelijk om ongeveer 26 miljoen CD14+ myocyten te verzamelen uit de geoogste PBMC’s, die eer…

Discussion

Deze studie toont een gestandaardiseerde in vitro methode voor het genereren en fenotyperen van boviene MoDC’s en hun daaropvolgende gebruik bij het meten van de vaccinimmunogeniciteit van een commercieel vaccin (bijv. RV). Runder-MoDC’s kunnen worden gebruikt als een hulpmiddel voor het screenen van potentiële vaccinantigenen tegen veeziekten en het voorspellen van hun potentiële klinische impact op basis van immuunresponsen voordat wordt overgegaan tot in vivo dierproeven. De gegenereerde MoDC’s wer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Dr. Eveline Wodak en Dr. Angelika Loistch (AGES) voor hun steun bij het bepalen van de gezondheidsstatus van de dieren en voor het verstrekken van BTV, Dr. Bernhard Reinelt voor het verstrekken van runderbloed en Dr. Bharani Settypalli en Dr. William Dundon van de IAEA voor nuttig advies over respectievelijk de real-time PCR-experimenten en taalbewerking.

Materials

ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism – GraphPad 5 Software  Dotmatics Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R., Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. , 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -. J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don’t know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -. R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz – TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118 Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005)
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  36. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  37. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  38. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  39. Cho, K. -. J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What’s the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  41. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  42. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  43. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  44. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  45. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  46. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  47. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  48. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  49. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Play Video

Cite This Article
Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

View Video