Describimos un protocolo que detalla el aislamiento de criptas colónicas murinas para el desarrollo de colonoides tridimensionales. Los colonoides establecidos se pueden diferenciar terminalmente para reflejar la composición celular del epitelio del huésped antes de recibir un desafío inflamatorio o ser dirigidos a establecer una monocapa epitelial.
El epitelio intestinal juega un papel esencial en la salud humana, proporcionando una barrera entre el huésped y el medio externo. Esta capa celular altamente dinámica proporciona la primera línea de defensa entre las poblaciones microbianas e inmunitarias y ayuda a modular la respuesta inmunitaria intestinal. La alteración de la barrera epitelial es una característica distintiva de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y es de interés para la orientación terapéutica. El sistema de cultivo de colonoides tridimensionales es un modelo in vitro extremadamente útil para estudiar la dinámica de las células madre intestinales y la fisiología de las células epiteliales en la patogénesis de la EII. Idealmente, el establecimiento de colonoides a partir del tejido epitelial inflamado de los animales sería más beneficioso para evaluar las influencias genéticas y moleculares en la enfermedad. Sin embargo, hemos demostrado que los cambios epiteliales in vivo no se retienen necesariamente en colonoides establecidos a partir de ratones con inflamación aguda. Para abordar esta limitación, hemos desarrollado un protocolo para tratar los colonoides con un cóctel de mediadores inflamatorios que suelen estar elevados durante la EII. Si bien este sistema se puede aplicar de forma ubicua a diversas condiciones de cultivo, este protocolo enfatiza el tratamiento tanto en colonoides diferenciados como en monocapas bidimensionales derivadas de colonoides establecidos. En un entorno de cultivo tradicional, los colonoides se enriquecen con células madre intestinales, lo que proporciona un entorno ideal para estudiar el nicho de las células madre. Sin embargo, este sistema no permite un análisis de las características de la fisiología intestinal, como la función barrera. Además, los colonoides tradicionales no ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta celular de las células epiteliales terminalmente diferenciadas a los estímulos proinflamatorios. Los métodos aquí presentados proporcionan un marco experimental alternativo para abordar estas limitaciones. El sistema de cultivo monocapa bidimensional también ofrece una oportunidad para el cribado terapéutico de fármacos ex vivo. Esta capa polarizada de células puede ser tratada con mediadores inflamatorios en el lado basal de la célula y concomitantemente con terapias putativas por vía apical para determinar su utilidad en el tratamiento de la EII.
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica, remitente y recurrente caracterizada por episodios de inflamación y quiescencia clínica. La etiología de la EII es multifactorial, pero los rasgos característicos clave de la enfermedad incluyen una función de barrera defectuosa y un aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal, además de cascadas de señalización proinflamatoria activadas dentro del compartimento epitelial 1,2. Se han utilizado varios modelos in vitro e in vivo para recapitular la respuesta epitelial durante la EII, incluyendo cultivos celulares y modelos murinos de inflamación3. Sin embargo, todos estos sistemas tienen importantes deficiencias que limitan su capacidad para recapitular los cambios epiteliales durante la EII4. La mayoría de las líneas celulares utilizadas para estudiar la EII están transformadas, tienen la capacidad de formar una monocapa y pueden diferenciarse3 pero propagarse intrínsecamente de manera diferente a las células epiteliales intestinales no transformadas en el huésped. Para estudiar la EII se utilizan varios modelos murinos diferentes de inflamación, algunos de los cuales incluyen modelos knockout, modelos infecciosos, modelos inflamatorios químicos y modelos de transferencia de células T 5,6,7,8. Si bien cada uno puede estudiar ciertos aspectos etiológicos de la EII, como las predisposiciones genéticas, la disfunción de barrera, la desregulación inmunitaria y el microbioma, su capacidad para estudiar la naturaleza multifactorial de la enfermedad está limitada.
Los organoides intestinales, incluidos los enteroides y los colonoides, se han establecido en la última década como un modelo in vitro útil para estudiar no solo la dinámica de las células madre intestinales, sino también su papel que desempeñan la integridad de la barrera y la función del epitelio intestinal en la homeostasis y la enfermedad intestinales. Estas entidades han contribuido significativamente a nuestra comprensión de la patogénesis de la EII9 y han abierto nuevas oportunidades para la medicina personalizada. Los colonoides, o cultivos de tejido autoorganizados derivados de células madre del colon, se han desarrollado a partir de tejido murino y humano en un proceso que permite que las células madre ubicadas dentro de las criptas intestinales se propaguen y se mantenganindefinidamente. El nicho de las células madre in vivo se basa en factores extracelulares para apoyar su crecimiento, en particular la señalización canónica Wnt y las vías de señalización de proteínas morfogénicas óseas11. La adición de estos factores promueve la salud y la longevidad de los colonoides, pero también conduce el cultivo hacia un estado similar al de las células madre que no refleja la arquitectura celular epitelial in vivo, que consiste tanto en células que se renuevan a sí mismas como en células diferenciadas terminalmente12,13. Si bien la funcionalidad del epitelio intestinal depende de la interferencia continua entre el compartimento de las células madre y las células diferenciadas, la capacidad de tener ambos en un sistema de cultivo de colonoides es bastante limitada. A pesar de estas limitaciones, el sistema de cultivo de organoides sigue siendo el estándar de oro para estudiar las propiedades intrínsecas del epitelio ex vivo. No obstante, es posible que sea necesario considerar estrategias de cultura alternativas para responder a la pregunta científica en cuestión.
Se ha demostrado que los ratones en un régimen continuo de 7 días de sulfato de sodio de dextrano (DSS) desarrollan inflamación epitelial y disfunción de barrera14. Además, el fallo de la biogénesis mitocondrial y la reprogramación metabólica dentro del epitelio intestinal, que han demostrado ser evidentes en la EII humana, también se han capturado en este modelo DSS de colitis15. Sin embargo, nuestros datos preliminares demuestran que las características de la falla de la biogénesis mitocondrial no se conservan en los colonoides derivados de las criptas de los animales tratados con DSS (Figura suplementaria 1). Por lo tanto, se deben utilizar métodos de cultivo alternativos cuando se examina cómo la inflamación impulsa los cambios epiteliales durante la inflamación intestinal murina. Aquí, describimos un protocolo que hemos desarrollado que describe 1) cómo aislar criptas de tejido colónico completo para el establecimiento de colonoides murinos, 2) cómo diferenciar terminalmente esta población celular para reflejar la población celular tal como se encuentra in vivo, y 3) cómo inducir inflamación en este modelo in vitro . Para estudiar las interacciones farmacológicas dentro del epitelio inflamado, hemos desarrollado un protocolo para establecer monocapas bidimensionales (2D) a partir de colonoides murinos que pueden ser tratadas basalmente con mediadores inflamatorios y tratadas apicalmente con terapias farmacológicas.
El desarrollo de organoides ha revolucionado la forma en que la comunidad científica estudia los sistemas de órganos in vitro con la capacidad de recapitular parcialmente la estructura y función celular de un animal o humano en un plato. Además, los sistemas organoides derivados de humanos con enfermedades ofrecen una herramienta prometedora para la medicina personalizada que podría guiar la toma de decisiones terapéuticas. Aquí, describimos un protocolo de aislamiento de criptas que funciona bien e intro…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Grants R01DK120986 (a K.P.M.).
0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |