为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎,一种多发性硬化症的动物模型,用含有自身抗原的油包水乳剂对小鼠进行免疫并完成弗氏佐剂。虽然存在用于制备这些乳液的几种方案,但本文介绍了一种用于乳液制备的快速、简单和标准化的均质化方案。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)与多发性硬化症(MS)具有相似的免疫学和临床特征,因此被广泛用作识别新药物靶点以更好地治疗患者的模型。MS 的特征是几种不同的病程:复发缓解型 MS (RRMS)、原发性进行性 MS (PPMS)、继发性进行性 MS (SPMS) 和罕见的进行性复发型 MS (PRMS)。虽然动物模型不能准确地模仿所有这些对比鲜明的人类疾病表型,但有一些EAE模型反映了MS的一些不同临床表现。例如,C57BL / 6J小鼠中髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的EAE模仿人PPMS,而SJL / J小鼠中髓磷脂蛋白(PLP)诱导的EAE类似于RRMS。其他自身抗原,如髓鞘碱性蛋白(MBP)和许多不同的小鼠品系也用于研究EAE。为了在这些自身抗原免疫EAE模型中诱导疾病,制备油包水乳剂并皮下注射。大多数EAE模型还需要注射百日咳毒素才能发展疾病。为了获得一致且可重现的EAE诱导,需要详细的方案来制备试剂以产生抗原/佐剂乳剂。这里描述的方法利用标准化方法来生成油包水乳液。它简单快速,使用振荡均质机代替注射器来制备质量控制乳液。
免疫耐受性的破坏可导致自身免疫性疾病的产生,例如多发性硬化症(MS)。据估计,全世界有280万人患有MS1。尽管MS的确切原因在很大程度上仍未知,但自身反应性T细胞和B细胞的失调以及Treg功能的缺陷在该疾病的发病机制中起着重要作用2,3。
自身免疫性疾病的动物模型是研究潜在治疗方式的重要工具。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型已被对MS4感兴趣的研究人员使用了近一个世纪。在早期的实验中,该疾病的发病率相对较低。引入含有 分枝杆菌 和百日咳毒素的完全弗氏佐剂(CFA)能够在小鼠中一致地诱导EAE4。最重要的是,有必要将CFA与中枢神经系统(CNS)特异性抗原混合,以产生均匀的油包水乳液以诱导EAE。目前最常见的EAE模型是基于用致脑肽对小鼠进行主动免疫。小鼠的遗传背景在疾病易感性中起重要作用,髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和髓鞘蛋白脂蛋白(PLP139-151)肽分别用于诱导C57BL / 6J和SJL小鼠的EAE,5。然而,也可以使用其他小鼠品系和CNS衍生的肽。
CFA/肽乳剂的质量是决定主动免疫EAE模型6中疾病外显率的关键因素。必须通过将溶解在水性缓冲液中的致脑肽与CFA混合来制备均匀的油包水乳液,否则动物不会患上这种疾病。关于CFA/肽乳液的制备已经发表了许多方案。实例包括使用涡旋7、超声处理8、注射器和三通T连接器9、或仅使用一个注射器5。然而,所有这些方法都难以标准化,并且通常与冗长而复杂的协议相关联。
与上述所有方法相比,此处描述的用于乳液制备的简单方法具有人与人之间没有差异且相对较快的优点。乳液由均质机以设定的速度、时间和温度摇动试剂产生,确保快速一致的结果。除了在EAE模型中诱导疾病外,该方法还可用于研究其他自身免疫性疾病模型,例如胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)和抗原诱导的关节炎(AIA)6。因此,预计该方法可用于在依赖于含有自身抗原的油包水乳剂的其他动物模型中持续诱导疾病,例如实验性自身免疫性神经炎(EAN)10,实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)11,自身免疫性葡萄膜炎(EAU)12和重症肌无力(MG)13。该方法还持续诱导一般免疫反应,例如延迟型超敏反应(DTH)6,因此可用于提供癌症和疟疾疫苗(见讨论)。
因此,已经开发了一种快速(总制备时间~30分钟),简单(所有试剂都可以提前制备并储存)和标准化(使用振荡均质器完成乳液)的方法,并在此介绍。使用该协议制备的CFA /抗原乳剂在自身免疫动物模型中始终诱导疾病。
油包水乳剂,如抗原/弗氏佐剂,已被用于诱导EAE17超过半个世纪。目前还没有独立于人类影响的抗原乳剂制备标准化方法。使用注射器手动混合是大多数实验室的标准,但是这种方法非常耗时,通常会导致材料过度损失,并且质量因制备它的科学家而异。
本手稿中介绍的方法使用标准振荡均质机制备抗原/CFA 乳剂。此外,这里使用的所有试剂都可以等分并长…
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢隆德大学的动物饲养单位Camilla Björklöv和Agnieszka Czopek的支持,以及英国牛津大学肯尼迪风湿病研究所的Richard Williams的建设性批评和语言支持,以撰写这份手稿。
1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |