В этом протоколе обсуждается подход к получению эпителиальных органоидов из первичной нормальной и опухолевой ткани молочной железы посредством дифференциального центрифугирования. Кроме того, включены инструкции по трехмерному культивированию, а также иммунофлуоресцентной визуализации встроенных органоидов.
Органоиды являются надежным методом моделирования ткани органа благодаря своим самоорганизующимся свойствам и сохранению функции и архитектуры после размножения из первичной ткани или стволовых клеток. Этот метод генерации органоидов отказывается от дифференцировки одноклеточных клеток через несколько пассажей и вместо этого использует дифференциальное центрифугирование для выделения органоидов эпителия молочной железы из механически и ферментативно диссоциированных тканей. Этот протокол обеспечивает оптимизированную технику быстрого получения мелких и крупных эпителиальных органоидов как из ткани молочной железы мыши, так и из ткани молочной железы человека в дополнение к методам встраивания органоидов в коллаген и базис внеклеточного матрикса. Кроме того, приведены инструкции по фиксации в геле и иммунофлуоресцентному окрашиванию с целью визуализации морфологии и плотности органоидов. Эти методологии подходят для множества последующих анализов, таких как совместное культивирование с иммунными клетками и моделирование метастазов ex vivo с помощью анализа инвазии коллагена. Эти анализы служат для лучшего выяснения поведения клеток и создания более полного понимания взаимодействий в микроокружении опухоли.
Способность моделировать эпителиальные клетки in vitro была основой современных биомедицинских исследований, поскольку она фиксирует клеточные особенности, которые недоступны in vivo. Например, выращивание эпителиальных клеточных линий в двумерной плоскости может дать оценку молекулярных изменений, происходящих в эпителиальной клетке во время пролиферации1. Кроме того, измерение динамической регуляции между передачей сигналов и экспрессией генов ограничено в системах in vivo 2. В исследованиях рака моделирование линии эпителиальных клеток рака позволило идентифицировать молекулярные драйверы прогрессирования заболевания и потенциальные мишени для лекарств3. Однако выращивание линий эпителиальных клеток рака в двумерной плоскости имеет ограничения, поскольку большинство из них генетически иммортализированы и модифицированы, часто клональны по своей природе, отобраны по их способности расти в нефизиологических условиях, ограничены в оценке трехмерной (3D) архитектуры опухолевой ткани и не адекватно моделируют взаимодействия микроокружения в реалистичной тканевой среде4. Эти ограничения особенно очевидны при моделировании метастазирования, которое in vivo включает в себя несколько различных биологических стадий, включая инвазию, распространение, циркуляцию и колонизацию в отдаленном участкеоргана 5.
Эпителиальные органоиды рака были разработаны для лучшего повторения 3D-среды и поведения опухолей 6,7,8. Органоиды были впервые разработаны из отдельных клеток кишечника LRG5+ и дифференцированы для представления 3D-структуры звеньев крипты-ворсинок, которые поддерживали иерархическую структуру тонкой кишки in vitro9. Этот подход позволил в режиме реального времени визуализировать и охарактеризовать самоорганизующуюся тканевую архитектуру в гомеостатических и стрессовых условиях. В качестве естественного расширения были разработаны органоиды эпителия рака для моделирования множества различных типов рака, включая колоректальный рак10, рак поджелудочной железы11, рак молочной железы12, печень13, легкие 14, мозг 15 и рак желудка16. Эпителиальные органоиды рака были использованы для характеристики эволюции рака17,18 и метастатического пространственно-временного поведения 19,20 и опроса гетерогенности опухоли 21 и тестирования химиотерапии 22. Раковые эпителиальные органоиды также были выделены и собраны во время текущих клинических испытаний для прогнозирования реакции пациента на противоопухолевые агенты и лучевую терапию ex vivo 8,23,24,25. Кроме того, системы, включающие раковые эпителиальные органоиды, могут быть объединены с другими нераковыми клетками, такими как иммунные клетки, для формирования более полной модели микроокружения опухоли для визуализации взаимодействий в режиме реального времени, раскрытия того, как раковые эпителиальные клетки изменяют фундаментальную природу цитотоксических эффекторных иммунных клеток, таких как естественные клетки-киллеры, и тестирования потенциальной иммунотерапии и антитело-лекарственной цитотоксической активности26, 27,28. В данной статье демонстрируется способ получения эпителиальных органоидов без пассажа и встраивания в коллаген и базальный внеклеточный матрикс (ECM). Кроме того, используются методы последующей визуализации изолированных органоидов.
В литературе описаны различные методы получения опухолевых органоидов. В этом протоколе описывается метод получения опухолевых органоидов непосредственно из опухоли без пассажа. Используя этот метод, опухолевые органоиды могут быть получены в течение нескольких часов после начала п…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано финансированием, предоставленным METAvivor, Фондом Питера Карлсона, Исследовательским фондом Терезы и Онкологическим центром Симмонса NCI / UTSW P30 CA142543. Мы выражаем признательность за помощь Общему ресурсу по управлению юго-западными тканями Техасского университета, общему ресурсу в Комплексном онкологическом центре Симмонса, который частично поддерживается Национальным институтом рака под номером P30 CA142543. Особая благодарность всем членам Chan Lab.
10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
10x DMEM | Sigma | D2429 | |
50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
bFGF | Sigma | F0291 | |
BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
Collagenase A | Sigma | C2139 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
Insulin | Sigma | #I9278 | |
Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |