Гипертермия, генерируемая высокоинтенсивным сфокусированным ультразвуком под магнитно-резонансным контролем: возможный метод лечения на модели рабдомиосаркомы у мышей

Summary

Здесь представлен протокол использования контролируемой гипертермии, генерируемой высокоинтенсивным сфокусированным ультразвуком под магнитно-резонансным контролем, для запуска высвобождения лекарства из чувствительных к температуре липосом в мышиной модели рабдомиосаркомы.

Abstract

Сфокусированный ультразвук высокой интенсивности под магнитно-резонансным контролем (MRgHIFU) является признанным методом получения локализованной гипертермии. Учитывая визуализацию в реальном времени и модуляцию акустической энергии, этот метод позволяет точно контролировать температуру в определенной области. С помощью этой неинвазивной неионизирующей технологии исследуются многие тепловые применения, такие как генерация гипертермии, для высвобождения лекарств из термочувствительных липосомальных носителей. Эти препараты могут включать химиотерапию, такую как доксорубицин, для которой желательно целевое высвобождение из-за системных побочных эффектов, ограничивающих дозу, а именно кардиотоксичности. Доксорубицин является основой для лечения различных злокачественных опухолей и обычно используется при рецидивирующей или рецидивирующей рабдомиосаркоме (РМС). RMS является наиболее распространенной солидной экстракраниальной опухолью мягких тканей у детей и молодых людей. Несмотря на агрессивную мультимодальную терапию, показатели выживаемости RMS остаются неизменными в течение последних 30 лет. Чтобы изучить решение для удовлетворения этой неудовлетворенной потребности, был разработан экспериментальный протокол для оценки высвобождения термочувствительного липосомального доксорубицина (TLD) в иммунокомпетентной сингенной модели мыши RMS с использованием MRgHIFU в качестве источника гипертермии для высвобождения лекарственного средства.

Introduction

Рабдомиосаркома (РМС) — это опухоль скелетных мышц, которая чаще всего встречается у детей и молодых людей¹. Локализованное заболевание часто лечится мультимодальным лечением, включая химиотерапию, ионизирующее излучение и хирургическое вмешательство. Использование схем химиотерапии с несколькими препаратами более распространено у педиатрических пациентов с улучшенными результатами по сравнению с их взрослыми коллегами²; Однако, несмотря на продолжающиеся исследования, 5-летняя выживаемость остается на уровне около 30% при наиболее агрессивной форме заболевания ^3,4. Стандарт химиотерапии представляет собой схему с несколькими препаратами, которая включает винкристин, циклофосфамид и актиномицин D. В случаях рецидива или рецидива заболевания используются альтернативные химиотерапии, включая стандартный (свободный) доксорубицин (ФД) и ифосфамид¹. В то время как все эти химиотерапии имеют системную токсичность, кардиотоксичность доксорубицина налагает пожизненное ограничение дозы ^5-7. Для увеличения количества препарата, доставляемого к опухоли, и минимизации системной токсичности были разработаны альтернативные лекарственные формы, включая липосомальную инкапсуляцию. Это может быть нетермочувствительный доксорубицин, который был одобрен для лечения рака молочной железы и гепатоцеллюлярной карциномы, или термочувствительный доксорубицин, для которого продолжаются клинические испытания 8,9,10,11,12,13. Альтернативные методы доставки липосомальных инкапсулированных лекарственных средств, такие как мультивезикулярные липосомы и лиганд-таргетные липосомы, были оценены и показывают перспективность для лечения опухолей⁹. В этом исследовании добавление тепла оказывает многофакторное воздействие, включая высвобождение^{лекарства 14}. Комбинация гипертермии (ГТ), генерируемой высокоинтенсивным сфокусированным ультразвуком (MRgHIFU) под магнитно-резонансным контролем (MRgHIFU) и термочувствительным липосомальным доксорубицином (TLD), является новым мультимодальным терапевтическим подходом для использования этого токсичного, но эффективного препарата для лечения RMS, минимизируя при этом токсичность, ограничивающую дозу, и потенциально увеличивая иммунный ответ на опухоль.

Доксорубицин быстро высвобождается из TLD при температурах >39 °C, что значительно выше средней температуры человеческого тела 37 °C, но недостаточно высоко, чтобы вызвать повреждение тканей или абляцию; это начинает происходить при 43 ° C, но происходит быстрее, когда температура приближается к 60 ° C¹⁵. Для получения ГТ in vivo использовались различные методы, включая лазеры, микроволны, радиочастотную абляцию и сфокусированный ультразвук, многие из которых являются инвазивными методами нагрева¹⁶. MRgHIFU – это неинвазивный, неионизирующий метод нагрева, который облегчает точные настройки температуры в ткани-мишени in situ. Магнитно-резонансная томография (МРТ) в решающей степени обеспечивает визуализацию в режиме реального времени, где можно использовать компьютерное программное обеспечение, для расчета термометрического измерения ткани на протяжении всего лечения; Впоследствии эти данные могут быть использованы для управления ультразвуковой терапией в режиме реального времени для достижения и поддержания желаемой заданной температуры¹⁷. MRgHIFU был протестирован на различных типах тканей и может использоваться для широкого спектра температурных процедур, от легкой ГТ до абляции, а также клинически для успешного лечения болезненных метастазов^{в кости 18}. Кроме того, было показано, что ГТ вызывает цитотоксичность опухоли, модулирует экспрессию белка и изменяет иммунный ответ в микроокружении опухоли 19,20,21,22. В одном исследовании сочетали легкую ГТ с TLD с последующей абляцией с MRgHIFU в синергетической модели^{R1 крысы 23}, что приводило к некрозу в ядре опухоли и доставке лекарства на периферию. Традиционно лучевая терапия использовалась в качестве вспомогательной терапии для повреждения опухолевых клеток и уменьшения рецидивов местного заболевания. Однако его использование ограничено пожизненным дозированием и нецелевым уроном¹. Таким образом, HT уникален тем, что он может вызывать некоторые из тех же эффектов без той же токсичности или ограничений.

Доклинические модели RMS на животных включают сингенные иммунокомпетентные модели и ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX) у хозяев с ослабленным иммунитетом. В то время как модели с ослабленным иммунитетом допускают рост опухолей человека, они не имеют соответствующего микроокружения опухоли и ограничены в своей способности изучать иммунный ответ²⁴. Мутация, активирующая FGFR4, является многообещающим маркером плохого прогноза и потенциальной терапевтической мишенью у взрослых и детей RMS ^1,25. В сингенных моделях RMS, разработанных в лаборатории Глэдди, опухоли способны расти в иммунокомпетентном хозяине, у которого развиваются врожденные и адаптивные иммунные реакции на опухоль²⁶. Поскольку ГТ влияет на иммунный ответ, наблюдение за изменением иммунного ответа мышей является ценным преимуществом этой модели опухоли. Чтобы проверить как реакцию опухоли на TLD по сравнению с FD, так и изменение иммунного ответа опухоли как на химиотерапию, так и на HT, был разработан и использован протокол для лечения сингенных опухолей RMS у мышей in vivo с использованием MRgHIFU и TLD, который находится в центре внимания этого исследования.

Protocol

Исследования проводились в соответствии с комитетами по уходу за животными с утвержденными протоколами использования животных под наблюдением ветеринарного врача в исследовательских центрах животных Центра феногеномики (TCP) и Центра ресурсов животных (ARC) Университетской сети здрав?…

Representative Results

Используя протокол гипертермии, генерируемый MRgHIFU, опухоли в задней конечности можно было последовательно нагревать до желаемой заданной температуры в течение всего периода лечения (на рисунке 4 показано репрезентативное лечение, 10 или 20 минут, n = 65). Чтобы лечение счита…

Discussion

Разработанный здесь протокол был использован для нацеливания на опухоли задних конечностей с использованием MRgHIFU для лечения легкой ГТ и высвобождения инкапсулированных препаратов из липосом in vivo. Во время пилотного исследования в этом протоколе было обнаружено несколько крити?…

Materials

1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08