Summary

טכניקה זעיר פולשנית, מדויקת ויעילה להזרקה תוך-תימית בעכברים

Published: August 23, 2022
doi:

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך רדיולוגיה התערבותי שנקבע להזרקה תוך-תימית בעכברים כדי למנוע את הסיכון לניתוח פתוח ולשפר את הדיוק של זריקות מלעוריות עיוורות.

Abstract

הזרקה תוך-תימית במודלים של עכברים היא טכניקה חשובה לחקר תפקוד התימיק ומערכת החיסון, כולל הפרעות גנטיות ונרכשות בתאי T. לשם כך נדרשות שיטות לתצהיר ישיר של ריאגנטים ו/או תאים לתוך בלוטת התימוס של עכברים חיים. שיטות מסורתיות של הזרקה תוך תמית כוללות ניתוחי חזה או זריקות עיוורות מלעוריות זעיר פולשניות, שלשתיהן יש מגבלות משמעותיות. מכשירי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד אפשרו הזרקות מלעוריות מונחות תמונה בעכברים, ובכך שיפרו מאוד את דיוק ההזרקה של גישת ההזרקה המלעורית ואפשרו הזרקה של מטרות קטנות יותר. עם זאת, הזרקות מונחות תמונה מסתמכות על שימוש במערכת מסילות משולבת, מה שהופך את זה להליך נוקשה וגוזל זמן. כאן מוצגת שיטה ייחודית, בטוחה ויעילה להזרקות תוך תימיות מלעוריות בעכברים, המבטלת את ההסתמכות על מערכת המסילה להזרקות. הטכניקה מסתמכת על שימוש ביחידת מיקרו-אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה כדי לדמות את בלוטת התימוס של העכבר באופן לא פולשני. באמצעות טכניקת יד חופשית, רדיולוג יכול למקם קצה מחט ישירות לתוך בלוטת התימוס של העכבר בהנחיה סונוגרפית. עכברים מנוקים ומורדמים לפני ההדמיה. עבור רדיולוג מנוסה המיומן בהליכים מונחי אולטרסאונד, תקופת הלמידה של הטכניקה המוצהרת היא קצרה למדי, בדרך כלל תוך פגישה אחת. לשיטה יש שיעור תחלואה ותמותה נמוך לעכברים והיא מהירה בהרבה מהטכניקות הקיימות כיום בסיוע מכני להזרקה מלעורית. היא מאפשרת לחוקר לבצע ביעילות זריקות מלעוריות מדויקות ואמינות של תימוזות בכל גודל (כולל איברים קטנים מאוד כמו תימוס של עכברים זקנים או מדוכאי חיסון) עם לחץ מינימלי על החיה. שיטה זו מאפשרת הזרקת אונות בודדות אם רוצים ומאפשרת ניסויים בקנה מידה גדול בשל האופי החוסך בזמן של ההליך.

Introduction

לתימוס יש תפקיד חיוני בהתפתחות תאי T ובחסינות. מחסור בתאי T, אשר יכול להיגרם על ידי התנוונות thymic, הפרעות גנטיות, זיהומים, וטיפולים בסרטן, בין היתר, מוביל לתמותה גבוהה ותחלואה 1,2. מודלים של עכברים הם הכרחיים הן במחקר אימונולוגיה בסיסית והן במחקר אימונולוגיה תרגומית, והם שימשו במשך עשרות שנים לחקר ביולוגיה תימית והתפתחות תאי T, כמו גם לפיתוח טיפולים עבור אלה הסובלים מתפקוד לקוי של בלוטת התימוס ומחסור בתאי T 3,4,5.

חלק מרכזי בחקר התימיקה היה הזרקה תוך-תמית של חומרים ביולוגיים כגון תאים, גנים או חלבונים במודלים של עכברים 6,7,8,9,10,11,12. שיטות הזרקה תוך-תימיות קונבנציונליות משתמשות בכריתת בית החזה ולאחר מכן בהזרקה תוך-תימית בהדמיה ישירה או בהזרקה מלעורית “עיוורת” למדיאסטינום. הגישה הניתוחית מגדילה באופן משמעותי את הסיכון לפנאומוטורקס, בין היתר. יתר על כן, הלחץ המוגבר במהלך ניתוח זה גורם לדיכוי חיסוני, ובכך עלול לפגוע בנתונים אימונולוגיים13. חוקרים מנוסים, לאחר תרגול מסוים, יכולים לבצע את טכניקת ההזרקה העיוורת, אך גישה זו פחות מדויקת ולכן מגבילה את הנבדקים הניסיוניים לעכברים צעירים עם תימוס גדול.

השימוש בהנחיית אולטרסאונד הוכנס כחלופה מדויקת וזעיר פולשנית לגישות ההזרקה התוך-תימיות המסורתיות14. עם זאת, הליך זה גוזל זמן רב בעת שימוש במערכת המסילה המשולבת במקום בטכניקת היד החופשית. ביצוע הזרקות עם תושבת ההזרקה דורש אופטימיזציה ומיקום קפדניים של המתמר בעזרת החיבורים השונים כגון מעמד המתמר והרכבתו, מערכת המיקום X, Y ו- Z, כמו גם הפעלה מיומנת של בקרות המיקרו-מניפולציה והרחבות מערכת המסילה. טכניקה חלופית פשוטה, הזרקת תימי מונחית אולטרסאונד, מוצגת כאן על ידי רדיולוג באמצעות גישה ביד חופשית15, שהיא גם חלופה מהירה וגם מדויקת זעיר פולשנית לשיטות שתוארו לעיל. חשוב לציין, ניתן לבצע את הגישה הנוכחית עם כל מערכת הדמיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה ללא צורך בתושבת הזרקה ומערכת מסילות משולבת. הוא שימושי במיוחד למחקרים הדורשים הזרקה של מספר גדול של עכברים11, לניסויים הכוללים הזרקה של שתי האונות התימיות, או להזרקה מדויקת של תימוזים קטנים בעכברים מזדקנים, מוקרנים או מדוכאי חיסון12.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים במרכז לגילוי וחדשנות (פרוטוקול IACUC 290). עבור המחקר הנוכחי, C57BL/6 עכברים (נקבה, 4-6 שבועות), C57BL/6 עכברים (נקבה, בת 6 חודשים), עכברים נקבות J:NU, עכברי נקבות NOD scid gamma (NSG) ו-B6; עכברי CAG-luc, -GFP שימשו כמודל העכבר הצעיר, מודל העכבר הזקן, מודל העירום האתימי, מודל ה?…

Representative Results

היישום המוצלח של טכניקה זו מסתמך על כמה צעדים מרכזיים שיש לעקוב אחריהם. ראשית, יש להבטיח זיהוי אמין של בלוטת התימוס עצמה. בעכברים צעירים, זה פשוט בגלל גודלה הגדול של הבלוטה (איור 3A). בעכברים מבוגרים או בעכברים מדוכאי חיסון, זה יכול להיות מאתגר יותר; עם זאת, זה עדיין אפשרי מאוד …

Discussion

הזרקה ידנית חופשית מונחית אולטרסאונד היא טכניקה מדויקת ביותר להעברת חומרי לימוד לבלוטת התימוס בצורה יעילה ואספטית. לאחר העיקור הראשוני של העור באתר ההזרקה, נשמרת סטריליות במהלך ההליך הודות לשימוש בכפפות סטריליות, כיסויי בדיקת אולטרסאונד סטריליים וג’ל אולטרסאונד סטרילי. בניגוד לגישה המל…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לריימונד ה. ת’ורנטון על עבודתו המוקדמת התובנה והמקיפה על טכניקה זו. מחקר זה מומן על ידי תמיכה במענקים מהמכון הלאומי לסרטן (NCI 1R37CA250661-01A1), האגודה לחקר לוקמיה בילדים, בית הספר לרפואה של מרידיאן האקנסק, וקרן HUMC / התמודדות עם סרטן ילדים.

Materials

Aquasonic 100 Ultrasound Gel Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) 01-01 Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 025854 Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) 328431 Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse – aged The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 000664 age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse – young The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 000664 age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL CareFusion (El Paso, TX, USA) 260449 chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator Cardinal Health (Dublin, OH, USA) A5000-2 Sterile, 6"
D-Luciferin Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) LUCK-1G
Isoflurane Henry Schein (Melville, NY, USA) 1182097
IVIS Lumina X5 PerkinElmer (Melville, NY, USA) n/a In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 007850 Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape Cardinal Health (Dublin, OH, USA) 1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) 56892 Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) n/a Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 005557 Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x Corning (Corning, NY, USA) 21-040-CV
Puralube Vet Ointment Med Vet International PH-PURALUBE-VET Eye ointment
Sheathes Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) 10040 Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) EZ-17 85 Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals (Solon, OH, USA) 91691049
Vevo 3100 Imaging System FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Procedural platform

References

  1. Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
  2. Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
  3. Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
  4. Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
  5. McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
  6. Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
  7. Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
  8. Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
  9. Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
  10. Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
  11. Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
  12. Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O’Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
  13. Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
  14. Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
  15. Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
  16. Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
  17. Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
  18. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
  19. de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).

Play Video

Cite This Article
McGuire, M. T., Tuckett, A. Z., Myint, F., Zakrzewski, J. L. A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice. J. Vis. Exp. (186), e64309, doi:10.3791/64309 (2022).

View Video