Een noodzakelijke stap in de ontwikkeling van aptameren tegen kanker is om de binding aan het doelwit te testen. We demonstreren een flowcytometrische test om deze binding te bestuderen, waarbij we het belang benadrukken van het opnemen van een negatieve controle aptamer en kankercellen die positief of negatief zijn voor dat specifieke eiwit.
Een belangrijke uitdaging bij het ontwikkelen van een antikanker aptamer is om efficiënt de selectiviteit en specificiteit van het ontwikkelde aptamer voor het doeleiwit te bepalen. Vanwege de verschillende voordelen ten opzichte van monoklonale antilichamen, heeft de ontwikkeling van aptameren een enorme populariteit gewonnen onder kankeronderzoekers. Systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is de meest gebruikelijke methode voor het ontwikkelen van aptameren die specifiek zijn voor eiwitten van belang. Na SELEX versnelt een snelle en efficiënte bindingstest het identificatieproces en bevestigt de selectiviteit en specificiteit van het aptamer.
Dit artikel verklaart een stap-voor-stap flow cytometrische bindingstest van een aptamer specifiek voor epitheliale cellulaire adhesie molecuul (EpCAM). Het transmembraanglycoproteïne EpCAM is overexpressie in de meeste carcinomen en speelt een rol bij het initiëren van kanker, progressie en metastase. Daarom is het een waardevolle kandidaat voor gerichte medicijnafgifte aan tumoren. Om de selectiviteit en specificiteit van de aptamer voor de membraangebonden EpCAM te evalueren, zijn EpCAM-positieve en -negatieve cellen vereist. Daarnaast is een niet-bindende EpCAM-aptamer met een vergelijkbare lengte en 2-dimensionale (2D) structuur als de EpCAM-bindende aptamer vereist. De bindingstest omvat verschillende buffers (blokkeringsbuffer, wasbuffer, incubatiebuffer en FACS-buffer) en incubatiestappen.
Het aptamer wordt geïncubeerd met de cellijnen. Na de incubatie- en wasstappen worden de cellen geëvalueerd met behulp van een gevoelige flowcytometrietest. Analyse van de resultaten toont de binding van de EpCAM-specifieke aptamer aan EpCAM-positieve cellen en niet de EpCAM-negatieve cellen. In EpCAM-positieve cellen wordt dit weergegeven als een bandverschuiving in de binding van de EpCAM-aptamer naar rechts in vergelijking met de niet-bindende aptamercontrole. In EpCAM-negatieve cellen overlappen de overeenkomstige banden van EpCAM-bindende en -niet-bindende aptameren elkaar. Dit toont de selectiviteit en specificiteit van de EpCAM aptamer. Hoewel dit protocol gericht is op de EpCAM aptamer, is het protocol van toepassing op andere gepubliceerde aptameren.
Kanker is wereldwijd nog steeds een van de belangrijkste doodsoorzaken1. Ondanks de aanzienlijke verbetering van de behandeling van kanker in de afgelopen decennia, is de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen kanker nog steeds een veelbesproken onderwerp. Dit komt omdat chemotherapie, als de steunpilaar van de behandeling van kanker, gepaard gaat met ernstige bijwerkingen die de therapietrouw van de patiënt beperken. Bovendien heeft chemotherapie-geïnduceerde kankerresistentie tegen behandeling de toepassing ervan beperkt als de enige keuze voor medische interventie. De toepassing van monoklonale antilichamen (mAbs) introduceerde een verbeterde respons op kankerbehandelingen2. De reden voor het gebruik van mAbs was om de werkzaamheid van chemotherapeutica te verbeteren en hun bijwerkingen te minimaliseren. Het beheer van mAbs werd echter ook een uitdaging. Dit kwam niet alleen door de door mAb geïnduceerde immunologische reacties, maar ook door de dierafhankelijke en dure productiekosten en moeilijke bewaarcondities3. Introductie van aptameren in de jaren 19904 wekte nieuwe hoop in de behandeling van kanker, omdat de toepassing van aptameren de uitdagingen in verband met mAbs zou kunnen aanpakken.
Aptameren zijn korte nucleïnezuursequenties die specifiek voor een bepaald doelwit worden geproduceerd. Systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is een veelgebruikte methode bij de productie van aptameren. In SELEX wordt het eiwit van belang geïncubeerd met een bibliotheek van willekeurige nucleotidesequenties en door middel van een reeks iteratieve cycli wordt de aptamer die specifiek is voor dat eiwit gezuiverd. Aptamers hebben een vergelijkbare selectiviteit en specificiteit als mAbs, en daarom laat de ontwikkeling van geneesmiddelen op dit gebied veelbelovende toekomstige toepassingen zien. Aptameren die specifiek zijn voor kankerbiomarkers kunnen worden toegepast als afzonderlijke geneesmiddelen en diagnostische hulpmiddelen voor kanker 5,6,7. Vanwege hun nano-formaat structuur kunnen deze aptameren ook fungeren als medicijndragers om cytotoxische middelen specifiek aan de tumor af te leveren8. Dit zou de werkzaamheid van gerichte medicijnafgifte verhogen en chemotherapie-geassocieerde, off-target bijwerkingen verminderen. Bovendien hebben deze nanogeneesmiddelen een hoge weefselpenetratie, waardoor ze een wenselijke kandidaat zijn voor toediening en behandeling van geneesmiddelen met diepe tumoren. Aptameren kunnen ook worden ontworpen om zich te richten op de transporters die tot expressie komen op de bloed-hersenbarrière (BBB) om de medicijnafgifte aan hersentumoren te verbeteren9. Een goed voorbeeld van zo’n aptamer zijn bifunctionele aptameren, gericht op de transferrinereceptor (TfR)10 om de medicijnafgifte over de BBB te verbeteren en een cytotoxische medicijnlading aan tumorcellen te leveren11.
Ondanks alle voordelen van aptameren, heeft de ontwikkeling van geneesmiddelen op dit gebied nog geen op de markt gebracht, succesvol medicijn tegen kanker opgeleverd. Een reden hiervoor zou het gebrek aan standaard en reproduceerbare methoden kunnen zijn die wereldwijd kunnen worden gevolgd door onderzoekers in het veld. In dit artikel wordt een stapsgewijs protocol van een aptamerbinding aan een inheems eiwit op het celoppervlak gedemonstreerd. Dit protocol is een eerste vereiste stap in de preklinische beoordeling van antikanker aptameren. De test wordt uitgevoerd om de selectiviteit en specificiteit aan te tonen van de gezuiverde aptamer verzameld uit SELEX of een gepubliceerde aptamersequentie voor bevestiging van selectiviteit en specificiteit. Deze flowcytometrische assay is een snelle, betrouwbare, gevoelige test die nauwkeurig de selectiviteit en specificiteit van het aptamer laat zien, waarbij de aptamer wordt getest tegen eiwitten op het celoppervlak 12,13,14. Deze methode wordt gedemonstreerd met behulp van de binding van een aptamer specifiek voor EpCAM getoond in dit artikel15. EpCAM, als een transmembraan glycoproteïne, speelt een rol bij tumorcelsignalering, progressie, migratie en metastase16,17. Om de selectiviteit en specificiteit van deze aptamer aan te tonen, werden EpCAM-positieve en -negatieve kankercellen gebruikt. De eerder ontwikkelde EpCAM-specifieke aptamer, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), en een negatieve controle aptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), werden gebruikt als EpCAM-bindende en -niet-bindende aptameren, respectievelijk10. Het 3′-uiteinde van zowel TEPP als TENN werd gelabeld met een TYE665-fluorofoor.
TEPP is een bifunctionele aptamer die zich richt op EpCAM van het ene uiteinde en TfR van het andere uiteinde. Dit heeft TEPP een geschikte kandidaat gemaakt voor medicijnafgifte aan EpCAM + hersentumoren. Met behulp van het TfR-specifieke uiteinde doorkruist TEPP de bloed-hersenbarrière en met behulp van het EpCAM-specifieke uiteinde vindt het de tumor en levert het zijn lading (bijv. Cytotoxische geneesmiddelen) aan de tumor. TENN heeft een vergelijkbare lengte en 2D-structuur als TEPP, maar het heeft geen affiniteit voor de EpCAM of TfR en is daarom een geschikte negatieve controle aptamer. Met behulp van TEPP en TENN wordt in dit artikel het testen van de binding van een aptamer aan het doeleiwit met behulp van flowcytometrie getoond. Dit protocol is van toepassing op de ontwikkeling van celspecifieke aptameren. Het is ook van toepassing op verdere complementaire en bevestigingsanalyses van de aptamersequenties die beschikbaar zijn in de literatuur. Het protocol kan ook worden gebruikt door degenen die nieuw zijn in het aptamer-veld en die kijken naar het gebruik van een eerder gepubliceerde aptamer voor hun onderzoeks- en ontwikkelingsdoeleinden (R &D). In dit artikel worden twee aptamersequenties bestudeerd die beschikbaar zijn in de literatuur.
De belangrijkste uitdaging bij het ontwikkelen van nieuwe aptameren is het ontbreken van standaardrichtlijnen die van toepassing zijn op verschillende stappen van dit proces. McKeague et al. hebben onlangs enkele van de bijbehorende uitdagingen aangetoond, die leiden tot onduidelijke presentaties van gegevens in publicaties en het niet repliceren van het onderzoek. Zij stelden fundamentele richtlijnen voor die nodig zijn om in aanmerking te komen bij het karakteriseren van aptameren19. Een aptamer…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen de SEED-financiering van het Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT), het “Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship” -programma aan de Deakin University en de “Australian Government Research Training Program Scholarship”.
1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |