Bereiding van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA's uit primaire en gekweekte cellen

Summary

Het huidige protocol biedt een efficiënte en flexibele methode om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische fracties met behulp van gekweekte cellen en vervolgens te valideren met behulp van qPCR. Dit dient effectief als vervanging voor andere RNA-voorbereidingskits.

Abstract

De scheiding van intracellulaire componenten is al vele jaren een belangrijk hulpmiddel in de cellulaire biologie en heeft nuttig inzicht kunnen geven in hoe hun locatie hun functie kan beïnvloeden. In het bijzonder is de scheiding van nucleair en cytoplasmatisch RNA belangrijk geworden in de context van kankercellen en de zoektocht naar nieuwe doelen voor geneesmiddelen. Het kopen van kits voor nucleair-cytoplasmatische RNA-extractie kan duur zijn wanneer veel van de vereiste materialen te vinden zijn in een typische laboratoriumomgeving. Met behulp van de huidige methode, die duurdere kits of andere tijdrovende processen kan vervangen, zijn alleen een zelfgemaakte lysisbuffer, een benchtopcentrifuge en RNA-isolatiezuiveringskolommen nodig om nucleair en cytoplasmatisch RNA te isoleren. Lysisbuffer wordt gebruikt om het buitenmembraan van de cel zachtjes te lyseren zonder de integriteit van de nucleaire envelop aan te tasten, waardoor de intracellulaire componenten kunnen worden vrijgegeven. Vervolgens kunnen de kernen worden geïsoleerd door een eenvoudige centrifugatiestap, omdat ze een hogere dichtheid hebben dan de lysisoplossing. Centrifugatie wordt gebruikt om deze gebieden te scheiden op basis van hun dichtheidsverschillen om subcellulaire elementen in de kern te isoleren van die in het cytoplasma. Zodra de centrifugatie de verschillende componenten heeft geïsoleerd, wordt een RNA-opruimkit gebruikt om het RNA-gehalte te zuiveren en wordt qPCR uitgevoerd om de scheidingskwaliteit te valideren, gekwantificeerd door de hoeveelheid nucleair en cytoplasmatisch RNA in de verschillende fracties. Statistisch significante niveaus van scheiding werden bereikt, wat de effectiviteit van het protocol illustreert. Bovendien kan dit systeem worden aangepast voor de isolatie van verschillende soorten RNA (totaal, klein RNA, enz.), Wat gerichte bestudering van cytoplasma-nucleusinteracties mogelijk maakt en helpt bij het begrijpen van de verschillen in de functie van RNA die zich in de kern en het cytoplasma bevinden.

Introduction

Cellulaire fractionering in subcellulaire componenten maakt de isolatie en studie van gedefinieerde biochemische domeinen mogelijk en helpt bij het bepalen van de lokalisatie van specifieke cellulaire processen en hoe dit hun functie kan beïnvloeden¹. Isolatie van RNA van verschillende intracellulaire locaties kan zorgen voor een verbeterde nauwkeurigheid van genetische en biochemische analyse van transcriptieniveaugebeurtenissen en andere interacties tussen de kern en het cytoplasma, wat dient als het primaire doel van het huidige protocol². Dit protocol is ontwikkeld om de isolatie van cytoplasmatische en nucleaire RNA’s te garanderen om hun respectieve rollen in nucleaire export te bepalen en om te begrijpen hoe de subcellulaire lokalisatie van RNA’s in de kern en het cytoplasma hun functie in cellulaire processen kan beïnvloeden. Met behulp van materialen uit een typische laboratoriumomgeving was het mogelijk om nucleaire en cytoplasmatische fractionering effectiever en goedkoper te bereiken dan eerder vastgestelde protocollen zonder de kwaliteit van de resultaten in gevaar te brengen³.

Bovendien kan de uitwisseling van moleculen tussen het cytoplasma en de kern direct worden bestudeerd door deze regio’s te scheiden. Meer specifiek is het begrijpen van het transcriptoom essentieel voor het begrijpen van ontwikkeling en ziekte. RNA’s kunnen zich echter op elk moment op verschillende rijpingsniveaus bevinden en kunnen de downstream-analyse bemoeilijken. Dit protocol maakt het mogelijk om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische subcellulaire fracties, wat kan helpen bij studies van RNA en een beter begrip van een bepaald RNA van belang mogelijk maakt, zoals de lokalisatie van niet-coderende RNA’s of analyse van splice junctions binnen de kern.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA’s, waaronder mRNA’s, rRNA’s en lange niet-coderende RNA’s (lncRNA’s), vanwege de grootteselectiviteit van de gebruikte RNA-zuiveringskolom, die kan worden gewijzigd om andere RNA’s van belang te isoleren. Voorheen was de functie van lange RNA’s, zoals mRNA’s en lncRNA’s, sterk afhankelijk van hun respectieve lokalisatie binnen de cel ^4,5. Daarom is de studie van de export van de kern naar subcellulaire domeinen meer gericht op het begrijpen van de rol die het exporteren van RNA of andere cellulaire componenten op de cel kan hebben. lncRNA’s dienen als een goed voorbeeld hiervan, omdat hun vertaling en daaropvolgende effecten grotendeels afhankelijk zijn van nabijheid en interacties met andere vormen van RNA⁶. Bovendien is de uitwisseling van cellulaire elementen tussen nucleaire en cytoplasmatische regio’s gekoppeld aan resistentiemechanismen tegen verschillende kankerbehandelingen⁷. De isolatie van intracellulaire compartimenten heeft de ontwikkeling van nucleaire exportremmers mogelijk gemaakt, wat de effecten van resistentiemechanismen tegen verschillende therapieën heeft verminderd⁸.

Na het scheiden van nucleair en cytoplasmatisch RNA worden stappen uitgevoerd om het RNA van belang te zuiveren. Omdat RNA-zuiveringskits vaak worden aangetroffen in laboratoria en functioneren om lange RNA’s te zuiveren en te isoleren, dienen ze het doel van dit protocol goed. Voor RNA-zuivering is het genereren van 260:280-verhoudingen groter dan 1,8 van cruciaal belang om de kwaliteit van monsters voor RNA-sequencing of andere soortgelijke procedures te waarborgen die een hoge mate van zuiverheid en isolatie vereisen. Onregelmatige 260:280-waarden wijzen op fenolbesmetting, die een slechte isolatie aantonen en onnauwkeurige resultaten opleveren⁹.

Zodra de RNA-zuivering is voltooid en 260:280-waarden boven een acceptabel bereik liggen, werd qPCR gebruikt om de isolatieresultaten van nucleaire en cytoplasmatische fracties te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het interessegebied om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In dit protocol werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als nucleaire en cytoplasmatische markers, respectievelijk¹⁰. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering met MALAT1 aan te tonen, terwijl cytoplasmatische fractionering naar verwachting laag zal zijn. Omgekeerd, wanneer TUG1 wordt gebruikt, wordt verwacht dat cytoplasmatische fractioneringsniveaus hoger zijn dan nucleaire fractioneringsniveaus.

Met behulp van dit protocol was het mogelijk om RNA’s te isoleren op basis van hun positie van actie in de cel. Vanwege de wijdverspreide toegang tot veel materialen en het gebruik van alleen lysisbuffer- en op dichtheid gebaseerde centrifugatietechnieken tijdens dit experiment, is de toepasbaarheid op andere RNA-typen en andere cellulaire componenten wijdverspreid. Dit kan belangrijke informatie opleveren door licht te werpen op locatiespecifieke expressiegebeurtenissen die anders zonder scheiding niet van elkaar te onderscheiden zouden zijn.

Protocol

K562-cellen worden gebruikt voor deze studie. Dit protocol is geoptimaliseerd om te werken voor 1 x 106-5 x 106 miljoen cellen. De procedure kan echter worden opgeschaald voor grotere celhoeveelheden door de volumes op de juiste manier te verhogen. 1. Voorbereiding van de 0,25x lysisbuffer Bereid 0,25x lysisbuffer voor door de volgende componenten in tabel 1A te mengen.OPMERKING: Monsters vereisen ongeveer 300 μL van 0,25x …

Representative Results

Om er zeker van te zijn dat nucleaire en cytoplasmatische isolatie was bereikt, werd een qPCR uitgevoerd om de resultaten te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het gebied van belang om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In deze studie werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als respectievelijk nucleaire en cytoplasmatische primers. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering aan te tonen met MALAT1 als een positieve controle voor nucleai…

Discussion

Gedurende het protocol werden enkele stappen ondernomen om de elementen te optimaliseren om het meest effectief te zijn voor de cellijn van belang. Hoewel de stappen binnen het protocol relatief eenvoudig zijn, kunnen analyse en kleine aanpassingen tijdens kritieke aspecten van het protocol nodig zijn. De meest kritische stap in het protocol is het wijzigen van de concentratie van de lysisbuffer tot een juiste concentratie op basis van de cellijn van belang en het cellulaire doelwit. Aangezien het gebruik van lysisbuffer…

Materials

Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.