Das vorliegende Protokoll beschreibt drei Methoden zur Verabreichung kardioaktiver Therapeutika in einem Schweinemodell. Weibliche Landrassenschweine erhielten die Behandlung entweder: (1) Thorakotomie und transepikardiale Injektion, (2) kathetergestützte transendokardiale Injektion oder (3) intravenöse Infusion über die osmotische Minipumpe der Jugularvene.
Myokardinfarkt ist weltweit eine der häufigsten Todes- und Invaliditätsursachen, und es besteht ein dringender Bedarf an neuartigen kardioprotektiven oder regenerativen Strategien. Ein wesentlicher Bestandteil der Arzneimittelentwicklung ist die Bestimmung, wie ein neuartiges Therapeutikum verabreicht werden soll. Physiologisch relevante Großtiermodelle sind von entscheidender Bedeutung für die Beurteilung der Durchführbarkeit und Wirksamkeit verschiedener therapeutischer Verabreichungsstrategien. Aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit dem Menschen in Bezug auf die kardiovaskuläre Physiologie, die koronare Gefäßanatomie und das Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht ist das Schwein eine der bevorzugten Spezies bei der präklinischen Bewertung neuer Therapien für Myokardinfarkt. Das vorliegende Protokoll beschreibt drei Methoden zur Verabreichung kardioaktiver Therapeutika in einem Schweinemodell. Nach einem perkutan induzierten Myokardinfarkt erhielten weibliche Landrassen eine Behandlung mit neuartigen Wirkstoffen durch (1) Thorakotomie und transepikardiale Injektion, (2) katheterbasierte transendokardiale Injektion oder (3) intravenöse Infusion über eine osmotische Minipumpe der Halsvene. Die für jede Technik verwendeten Verfahren sind reproduzierbar, was zu einer zuverlässigen kardioaktiven Wirkstoffabgabe führt. Diese Modelle können leicht an individuelle Studiendesigns angepasst werden, und jede dieser Verabreichungstechniken kann verwendet werden, um eine Vielzahl möglicher Interventionen zu untersuchen. Daher sind diese Methoden ein nützliches Werkzeug für translationale Wissenschaftler, die neue biologische Ansätze zur Herzreparatur nach Myokardinfarkt verfolgen.
Die koronare Herzkrankheit (KHK) und der damit verbundene ST-Hebungs-Myokardinfarkt (STEMI) sind weltweit die häufigsten Todesursachen. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden große Fortschritte bei der Senkung der Krankenhaussterblichkeit von Patienten mit STEMI erzielt, und zwar durch das Aufkommen perkutaner Koronarinterventionen, fibrinolytischer Therapien und der Standardisierung von Behandlungsalgorithmen, um sicherzustellen, dass die Reperfusion rechtzeitig erreicht wird 1,2,3. Trotzdem stellt die mit STEMI verbundene Morbidität nach wie vor eine erhebliche Belastung dar, so dass ein großer Bedarf an der Entwicklung neuartiger kardioprotektiver und regenerativer Therapien besteht 2,3. Ein wesentlicher Bestandteil der Therapieentwicklung ist die Festlegung der Art und Weise, wie eine neuartige Therapie verabreicht werden soll4. Die Sicherheit, Wirksamkeit und Durchführbarkeit jeder Methode muss mit den Eigenschaften der Therapie selbst in Einklang gebracht werden.
Physiologisch relevante Großtiermodelle sind entscheidend für die Beurteilung dieser Eigenschaften verschiedener therapeutischer Verabreichungsstrategien5. Aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit dem Menschen in Bezug auf die kardiovaskuläre Physiologie, die koronare Gefäßanatomie und das Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht ist das Schwein eine der bevorzugten Spezies bei der präklinischen Bewertung neuer Therapien für Myokardinfarkt6. Wir haben zuvor ein porcines STEMI-Modell verwendet, um die reparative Kapazität einer rekombinanten Proteintherapie zu demonstrieren7, und untersuchen weiterhin neuartige pharmakologische, zelluläre und genetische Therapien mit diesem Modell. Hier werden drei Techniken der therapeutischen Verabreichung beschrieben, die in Schweinemodellen nach Infarktentstehung verwendet werden: Thorakotomie und transepikardiale Injektion, perkutane transendokardiale Injektion und jugularvenöse osmotische Minipumpenimplantation. Die ersten beiden Methoden ermöglichen eine lokale Gewebeabgabe, wodurch die erforderlichen Dosierungen, Off-Target-Effekte und der hepatische First-Pass-Metabolismus reduziertwerden 8,9,10. Die osmotische Minipumpe ermöglicht die kontinuierliche Verabreichung eines Medikaments mit einer kurzen Halbwertszeit, wodurch die Abhängigkeit von einer Infusionspumpe und einer patentierten intravenösen Kanüle entfällt, die beide in großen Tiermodellen schwierig zu implementieren sind.
Durch die Beschreibung dieser Techniken hofft man, dass dieser Artikel translationalen Wissenschaftlern helfen kann, neuartige kardioprotektive oder regenerative Wirkstoffe nach Myokardinfarkt in Großtiermodellen zu untersuchen.
Transepikardiale intramyokardiale Injektion
Dieses Verfahren hat den Vorteil der direkten kardialen Visualisierung und bietet nachweislich eine größere lokale Retention von Therapeutika als systemische Verabreichungsmethoden 9,10,14. Thorakotomien sind jedoch invasiv, erfordern erhebliche technische Fähigkeiten und stellen ein höheres Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko dar als andere diskutierte Methoden10,15. Die Kenntnis der kritischen und prekären Phasen des Verfahrens kann bei der Vermittlung dieses erhöhten Risikos helfen.
Bei der Manipulation des Herzens zur Freilegung der Herzspitze ist aufgrund des hohen Risikos von Herzrhythmusstörungen und der damit verbundenen hämodynamischen Beeinträchtigung große Vorsicht geboten. Kontinuierliche invasive Blutdrucküberwachung und Elektrokardiographie ermöglichen eine schnelle Identifizierung von Hypotonie oder instabilen Arrhythmien und erleichtern ein sofortiges Eingreifen und Korrigieren. Die vorübergehende Hypotonie kann im Allgemeinen mit Metaraminol-Boli behandelt werden. Eine anhaltende Hypotonie kann durch eine Reduzierung der Inhalationsanästhesie (sorgfältige Überwachung der Narkosetiefe) und den Beginn einer Vasopressor-Infusion vorübergehend reduziert werden, während gleichzeitig die Ursache der veränderten Hämodynamik bestimmt wird. Instabile Herzrhythmusstörungen wie ventrikuläre Tachykardie oder Kammerflimmern können durch elektrische Kardioversion mit oder ohne intravenöse Antiarrhythmika behandelt werden.
Ebenso wichtig für das Überleben der Tiere ist die erfolgreiche Entfernung von freiem Gas aus der Pleurahöhle vor dem Verschluss des Brustkorbs. Geschieht dies nicht, kann dies zur Entwicklung eines Pneumothorax führen, wodurch das Tier einem großen Risiko ausgesetzt ist, die Atmung zu beeinträchtigen und zu sterben, sobald es nach der Genesung vom mechanischen Beatmungsgerät getrennt wird. Der positive Atemwegsdruck muss mindestens 30 s lang aufrechterhalten werden, bis keine Blasbildung mehr beobachtet wird. Der Silikonschlauch wird nach Beendigung der Blasbildung sofort entfernt und der Thorax wird dann schnell geschlossen. Es ist auch möglich, einen Thorakostomieschlauch chirurgisch am Verschluss zu legen, der eine manuelle Entfernung von Luft und Entzündungsflüssigkeit in den nächsten 24-72 Stunden ermöglicht. Dies ist jedoch schwer sauber und intakt zu halten, insbesondere wenn die Tiere zusammen untergebracht sind. Eine Beschädigung oder Kontamination des Eileiters kann zu Pyothorax, Pneumothorax oder Sepsis führen. Unserer Erfahrung nach ist das Einsetzen einer temporären Thoraxdrainage nicht erforderlich, wenn freies Gas vor dem Thoraxverschluss ausreichend entfernt wird.
Perkutane transendokardiale intramyokardiale Injektion
Diese Methode der therapeutischen Verabreichung hat den Vorteil, dass sie eine lokale Gewebeabgabe mit geringerem Risiko ermöglicht, da sie im Vergleich zu einem chirurgischen Ansatz weniger invasiv ist10,14. Diese Technik wird bereits in Großtierstudien eingesetzt, wobei sowohl die Durchleuchtung als auch die elektromechanische Kartierung als Leitfaden dienen, wenn keine direkte Visualisierung möglich ist10,16,17.
Da das Herz nicht direkt sichtbar ist, ist es für den Verfahrenstechniker ratsam, bei der Auswahl einer Injektionsstelle orthogonale Durchleuchtungsansichten zu verwenden. Darüber hinaus ist die Injektion von verdünntem Jodkontrastmittel vor und Verabreichung des Therapeutikums äußerst wertvoll für die Bestätigung des Myokardkontakts. Ein geeigneter Kontakt kann durch die Beobachtung eines charakteristischen “myokardialen Rouge” bestätigt werden, das einer der wenigen Marker für den Injektionserfolg vor der Gewebeentnahme sein kann. Aufgrund des Risikos einer Kammerperforation wird auch empfohlen, die myokardiale Wanddicke an der gewählten Injektionsstelle größer als 9 mm zu sein14,16.
Jugularvenöse osmotische Minipumpe
Die osmotische Minipumpe ist ein beliebtes Gerät, das häufig in Kleintierstudien eingesetzt wird. Es besteht ein zunehmendes Interesse an der Verwendung dieses Geräts in Großtiermodellen 7,18,19, da es den einzigartigen Vorteil hat, ein Therapeutikum über einen bestimmten Zeitraum mit einer konstanten Rate zu verabreichen. Eine mögliche Einschränkung dieser Methode ist die Unfähigkeit, die Infusionsraten des Arzneimittels zu ändern oder zu stoppen, ohne die Pumpe auszutauschen oder zu entfernen. Dies sollte berücksichtigt werden, bevor eine Therapie auf diese Weise ausprobiert wird.
Diese Studie zeigte, dass diese Methode mit einer hohen Erfolgsrate bei Schweinen mit geringer Morbidität und Mortalität durchgeführt werden kann. Es muss beachtet werden, dass viele lebenswichtige Strukturen an die Operationsstelle angrenzen, darunter Lymphknoten, der Thymus und die Halsschlagader. Es wird dringend empfohlen, sich an die Methode zu halten und anatomische Texte20 zu konsultieren, um eine unbeabsichtigte Beschädigung dieser Strukturen zu vermeiden. Die besorgniserregendste Komplikation dieser Methode ist der hämorrhagische Schock aufgrund einer unbeabsichtigten Verletzung der Halsvene oder einer umgebenden Struktur. Daher ist es wichtig, dass das Weichgewebe, das die Halsvene umgibt, vorsichtig entfernt wird. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß ausgeführt wird, kann dies zu Schwierigkeiten beim Platzieren des Minipumpenschlauchs oder bei der Kontrolle unbeabsichtigter Blutungen führen.
In diesem Artikel wurden drei Methoden für die Verabreichung von kardioaktiven Therapeutika beschrieben. Trotz des berichteten Erfolgs jeder Technik gibt es inhärente Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. Invasive Verfahren (transepikardiale Injektion) ermöglichen eine erhöhte Genauigkeit der therapeutischen Verabreichung; Sie bergen jedoch ein höheres Risiko für potenziell tödliche Komplikationen. Darüber hinaus erfordert die invasive Verabreichung mehr technische Fähigkeiten, um das Risiko von Komplikationen zu minimieren. In ähnlicher Weise erfordert die fluoroskopisch gesteuerte, transendokardiale Injektion ein gewisses Maß an technischem Geschick für die Katheterisierung und Manipulation der Hardware. Wenn diese Methode unsachgemäß durchgeführt wird, sind Injektionsfehler und tödliche Komplikationen möglich.
Die beschriebenen Direktinjektionsverfahren ermöglichen die einmalige Verabreichung eines Therapeutikums in das Zielgewebe. Die jugularvenöse osmotische Minipumpe ermöglicht die systemische Verabreichung eines Therapeutikums über einen Zeitraum von 7 Tagen. Diese Methode ist vergleichsweise einfacher und mit weniger Risiko verbunden, setzt jedoch voraus, dass ein systemisches Therapeutikum den Weg zum Herzmuskel findet. Darüber hinaus ist es nach dem Einsetzen der Pumpe unmöglich, die Verabreichung abzubrechen oder die Dosisleistung zu ändern, ohne das Tier erneut zu betäuben und die Pumpe zu entfernen.
Alle in diesem Artikel beschriebenen Methoden wurden an Tieren am Tag oder 2 Wochen nach dem Myokardinfarkt durchgeführt. Daher kann in dieser Arbeit nicht über den Erfolg der genannten Methoden bei gesunden Tieren oder Tieren, die einer alternativen Herzpathologie unterzogen wurden, berichtet werden. Schließlich müssen die Pharmakologie und Biotechnologie jedes beabsichtigten Wirkstoffs sorgfältig geprüft werden, da dies von Natur aus mit der Wirksamkeit des gewählten Verabreichungsweges verbunden ist. Eine detaillierte Erörterung dieses Manuskripts würde den Rahmen sprengen.
Umfassende Darstellungen präklinischer Methoden kommen dem Tierschutz und der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft zugute. Die daraus resultierende verbesserte Reproduzierbarkeit von Verfahren und Ergebnissen führt zu weniger Komplikationen für die Tiergesundheit, einer geringeren Anzahl von Tieren, die erforderlich sind, um signifikante Ergebnisse zu erzielen, und einem größeren Vertrauen in die Versuchsergebnisse21,22. In diesem Artikel werden drei Methoden zur Verabreichung neuartiger Therapeutika zur Behandlung des Myokardinfarkts in einem Schweinemodell beschrieben. Durch die detaillierte Beschreibung der verwendeten Techniken und die Artikulation der Vorteile und Risiken jeder einzelnen wird erwartet, dass die Forscher in der Lage sein werden, konsistente und zuverlässige präklinische Modelle zu erstellen, die ihren Forschungszielen entsprechen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Health and Medical Research Council APP1194139/APP1126276 (JC), der National Stem Cell Foundation of Australia und des New South Wales Government Office of Health and Medical Research (JC) finanziert. DS wurde vom Royal Australasian College of Physicians, dem Institute of Clinical Pathology and Medical Research und dem Australian Government Research Training Program unterstützt. TD wurde vom Institute of Clinical Pathology and Medical Research, dem Penfolds Family Scholarship, dem National Health and Medical Research Council (APP2002783) und der National Heart Foundation of Australia (104615) unterstützt.
Central line placement | |||
2-0 sutures | Ethicon | JJ9220 | |
Arrow' Paediatric Two-Lumen Central Venous Catheterisation Set with Blue FlexTip Catheter (contains 18G cook needle and 0.035" J-tip wire) | Teleflex | CS-14502 | Central Line |
Green Fluorsence Protein (GFP) | Abcam | ab13970 | 1:100 dilution ratio |
Histology antibodies | |||
Ku80 | Cell Signalling Technology | C48E7 | 1:500 dilution ratio |
No. 11 scalpel | Swann-Morton | 203 | |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sterile ultrasound probe cover | Atris | 28041947 | |
Swine Jacket with Pocket, size 'Medium' | Lomir Biomedical | SS J2YJJET | |
Jugular vein osmotic minipump implantation | |||
Adson Brown Tissue Forceps | Icon Medical Supplies | KLINI316012 | |
Bellucci Self-Retaining Retractor | surgicalinstruments.net.au | group-24.26.02 | Self retaining tissue retractor |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Metzenbaum Scissors | Icon Medical Supplies | ARMO3250 | |
No. 22 scalpel blade | Swann-Morton | 208 | |
Nylon Suture (2-0, 3-0) | Ethicon | D9635, 663G | |
Osmotic Infusion Minipump | Alzet | 2ML1, 2ML2, 2ML4 | |
Vascular Silicone Ties | Vecmedical | 95001 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | W9982 | |
Percutaneous transedocardial injection | |||
Artis Zee' C-Arm Fluoroscopy | Siemens | IR-19-1994 | |
CARTO' 3 System | Biosense Webster | Electrophysiological Mapping Software & System | |
Cook Access Needle | Cook Medical | G07174 | Cannulation needle |
Fast-Cath' Introducer (6 French, 8 French) | Abbott | 406204, 406142 | Vascular sheath with introducer and guidewire |
Myostar' Injection Catheter | Biosense Webster | 121117S, 121119S, 1211120S | Intramyocardial injection catheter |
No.11 scalpel | Swann-Morton | 203 | |
Omnipaque' Iohexol Contrast | GE Healthcare | AUST R 39861 | Iodinated contrast agent |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sedation & general anaesthesia | |||
Compound Sodium Lactate Hartmann's Solution | Free flex | 894451 | |
Fentanyl 50 mcg/mL | Pfizer | AUST R 107027. | Intravenous anaesthesia and analgesia |
Forthane' Isoflurane | Abbott | AUST R 29656 | Inhalant anaesthetic |
GE Aestiva 5 Anaesthesia Machine | Datex Ohmeda | 17002-9, 17002A9 Avante Health Solutions | Anaesthetic Machine |
Hypnovel' Midazolam 5 mg/mL | Roche | AUST R 13726 | Sedative |
Intravenous cannula | BD Angiocath | 381137 | 20 gauge cannula |
Ketamil' Ketamine 10 mg/mL | Ilium | APVMA number: 51188c | Sedative |
Laryngoscope | Miller | VDI-6205 | |
Medetomidine 1 mg/mL | Ilium | APVMA number 64251; ACVM number A10488 | Sedative |
Metaraminol 10 mg/mL | Phebra | AUST R 284784 | Short-acting vasopressor |
Methadone 10 mg/mL | Ilium | APVMA number: 63712 | Sedative, Restricted drug |
Onsetron' Ondansetron 2 mg/mL | Accord Healthcare | AUST R 205593 | Anti-emetic |
Propofol-Lipuro' Propofol 10 mg/mL | Braun | AUST R 142906 | Intravenous anaesthetic |
Pulse Oximeter | Meditech | GVPMT-M3S | Portable pulse oximeter |
Shiley' Cuffed Basic Endotracheal Tube (Size 5.5 & 6.0) | Medtronic | 86108-, 86109- | |
Shiley' Intubating Stylet, 10 Fr | Medtronic | 85864 | |
Sodium Chloride 0.9% | Free flex | FAH1322 | |
Thoracotomy and epicardial Cell Injection | |||
27 G Insulin needle | Terumo | 51907 | |
Adson Brown Tissue Forceps | Icon Medical Supplies | KLINI316012 | |
CARTO' 3 System | Biosense Webster | Electrophysiological Mapping Software & System | |
Cefazolin 1 g Vial | AFT Pharmaceuticals | 9421900137367 CH2 | Antibiotic Prophylaxis |
Chest drainage tube | SurgiVet | SKU-336 | |
Cook Access Needle | Cook Medical | G07174 | Cannulation needle |
Cooley Sternotomy Retractor Paediatric | Millennium Surgical | 9-61287 | |
Durogesic' 100 mcg/h Fentanyl Patch | Janssen | AUST R 112371 | Postoperative analgesia |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Fast-Cath' Introducer (6 French, 8 French) | Abbott | 406204, 406142 | Vascular sheath with introducer and guidewire |
Lignocaine 20 mg/mL | Pfizer | AUST R 49296, AUST R 49297, AUST R 49293 and AUST R 49295. | Local anaesthesia, anti-arrhythmic |
Marcaine' Bupivacaine 0.5% | Pfizer | AUST R 48328 | Local anaesthesia. |
Metzenbaum Scissors | Icon Medical Supplies | ARMO3250 | |
No. 22 scalpel | Swann-Morton | 208 | |
Nylon Suture (2-0, 3-0) | Ethicon | D9635, JJ76264 | |
Size 1 PDS suture | Ethicon | JJ75414 | |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sterile gauze | Kerlix | KE5072 | |
Sterile laparotomy sponges | Propax | 2907950 | |
Thermocool Smartouch' Catheter | Biosense Webster | D133601, D133602, D133603 | Epicardial Mapping Catheter |