Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Summary

Questo protocollo descrive i metodi per condurre la risonanza magnetica, la pulizia e l’immunomarcatura di cervelli di topo intatti utilizzando iDISCO +, seguita da una descrizione dettagliata dell’imaging utilizzando la microscopia a foglio di luce e analisi a valle utilizzando NuMorph.

Abstract

La pulizia dei tessuti seguita dalla microscopia a foglio luminoso (LSFM) consente l’imaging a risoluzione cellulare della struttura cerebrale intatta, consentendo l’analisi quantitativa dei cambiamenti strutturali causati da perturbazioni genetiche o ambientali. L’imaging dell’intero cervello si traduce in una quantificazione più accurata delle cellule e nello studio delle differenze specifiche della regione che possono essere perse con la microscopia comunemente usata del tessuto fisicamente sezionato. L’uso della microscopia a foglio di luce per visualizzare i cervelli chiari aumenta notevolmente la velocità di acquisizione rispetto alla microscopia confocale. Sebbene queste immagini producano grandi quantità di dati strutturali cerebrali, la maggior parte degli strumenti computazionali che eseguono la quantificazione delle caratteristiche nelle immagini di tessuto eliminato si limitano a contare popolazioni cellulari sparse, piuttosto che tutti i nuclei.

Qui, dimostriamo NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un gruppo di strumenti di analisi, per quantificare tutti i nuclei e i marcatori nucleari all’interno delle regioni annotate di un cervello di topo postnatale giorno 4 (P4) dopo la pulizia e l’imaging su un microscopio a foglio di luce. Descriviamo la risonanza magnetica (MRI) per misurare il volume del cervello prima del restringimento causato dalle fasi di disidratazione della pulizia dei tessuti, la pulizia dei tessuti utilizzando il metodo iDISCO +, inclusa l’immunomarcatura, seguita dalla microscopia a foglio luminoso utilizzando una piattaforma disponibile in commercio per visualizzare il cervello dei topi a risoluzione cellulare. Dimostriamo quindi questa pipeline di analisi delle immagini utilizzando NuMorph, che viene utilizzato per correggere le differenze di intensità, cucire le tessere dell’immagine, allineare più canali, contare i nuclei e annotare le regioni del cervello attraverso la registrazione agli atlanti disponibili pubblicamente.

Abbiamo progettato questo approccio utilizzando protocolli e software disponibili pubblicamente, consentendo a qualsiasi ricercatore con il microscopio e le risorse computazionali necessarie di eseguire queste tecniche. Questi strumenti di pulizia dei tessuti, imaging e calcolo consentono la misurazione e la quantificazione dell’organizzazione tridimensionale (3D) dei tipi di cellule nella corteccia e dovrebbero essere ampiamente applicabili a qualsiasi progetto di studio su topi wild-type/knockout.

Introduction

L’imaging dell’intero cervello con risoluzione di una singola cellula è una sfida importante nelle neuroscienze. Le immagini cerebrali a risoluzione cellulare consentono un’analisi dettagliata e la mappatura a livello di sistema dei circuiti cerebrali e di come tali circuiti siano interrotti da fattori di rischio genetici o ambientali per disturbi neuropsichiatrici, comportamento cellulare negli embrioni in via di sviluppo e circuiti neurali nel cervello adulto ^1,2,3. Esistono diversi metodi istologici che consentono immagini ad alta risoluzione del cervello 3D ricostruito; tuttavia, queste tecniche richiedono attrezzature costose e specializzate, potrebbero non essere compatibili con l’immunomarcatura e la natura bidimensionale (2D) di alcuni metodi può portare a danni tissutali e taglio durante il sezionamento ^4,5.

I recenti progressi hanno fornito un approccio alternativo per l’imaging di interi cervelli che non richiede il sezionamento dei tessuti; Implicano l’uso della pulizia dei tessuti per rendere trasparente il cervello. La trasparenza si ottiene nella maggior parte dei metodi di pulizia dei tessuti sia rimuovendo i lipidi, in quanto sono una delle principali fonti di diffusione della luce, sia abbinando l’indice di rifrazione (RI) dell’oggetto con il RI della soluzione di immersione del campione durante l’imaging. La luce può quindi passare attraverso il confine tra i materiali senza essere dispersa 6,7,8,9.

I metodi di pulizia dei tessuti, come iDISCO+, sono spesso combinati con l’imaging 3D rapido utilizzando la microscopia a eccitazione a singolo fotone, come LSFM ^6,7,10. All’interno di tessuti trasparenti marcati con un fluoroforo, la microscopia a fluorescenza a foglio di luce immagini sezioni per eccitazione con un sottile piano di luce¹¹. Il vantaggio principale di LSFM è che una singola sezione ottica viene illuminata alla volta, con tutta la fluorescenza delle molecole all’interno di quella sezione eccitata, il che riduce al minimo il fotosbiancamento. Inoltre, l’imaging di un’intera fetta ottica consente il rilevamento basato su telecamera di quella fetta eccitata, aumentando la velocità rispetto alla scansione puntuale¹². LSFM produce in modo non distruttivo sezioni ottiche ben registrate che sono adatte per la ricostruzione 3D.

Mentre il metodo iDISCO+ consente una pulizia dei tessuti economica entro ~ 3 settimane, le fasi di disidratazione all’interno del protocollo possono portare al restringimento del tessuto e alla potenziale alterazione della morfologia del campione, influenzando così le misurazioni volumetriche ^6,10. L’aggiunta di un metodo di imaging secondario, come la risonanza magnetica, da utilizzare prima della procedura di pulizia del tessuto può misurare il grado di restringimento indotto dalla pulizia del tessuto attraverso il campione. Durante le fasi di disidratazione, le differenze nelle proprietà meccaniche tra la materia grigia e bianca possono portare a deformazioni non uniformi della materia cerebrale, con conseguenti deformazioni di volume indotte dalla pulizia dei tessuti dissimili tra campioni wild-type e mutanti e possono confondere le interpretazioni delle differenze volumetriche in questi campioni^10,13 . La risonanza magnetica viene eseguita prima perfondendo l’animale con un agente di contrasto (ad esempio, gadolinio), seguita dall’incubazione del tessuto estratto di interesse in una soluzione di immersione (ad esempio, fomblin) prima di imaging¹⁴. La risonanza magnetica è compatibile con la pulizia dei tessuti e l’esecuzione di LSFM sullo stesso campione.

LSFM viene spesso utilizzato per creare immagini di microscopia su larga scala per la visualizzazione qualitativa del tessuto cerebrale di interesse piuttosto che la valutazione quantitativa della struttura cerebrale (Figura 1). Senza una valutazione quantitativa, è difficile dimostrare differenze strutturali derivanti da insulti genetici o ambientali. Con il miglioramento delle tecnologie di pulizia dei tessuti e di imaging, insieme alla riduzione dei costi di archiviazione e potenza di calcolo, la quantificazione delle localizzazioni dei tipi di cellule all’interno del tessuto di interesse sta diventando più accessibile, consentendo a più ricercatori di includere questi dati nei loro studi.

Con oltre 100 milioni di cellule nel cervello del topo¹⁵ e sessioni di imaging dell’intero cervello in grado di generare terabyte di dati, vi è una crescente domanda di strumenti avanzati di analisi delle immagini che consentano una quantificazione accurata delle caratteristiche all’interno delle immagini, come le cellule. Esistono numerosi metodi di segmentazione per le immagini con eliminazione tissutale che applicano soglie per l’intensità della colorazione nucleare e filtrano oggetti con forme, dimensioni o densità predefinite^10,16,17,18. Tuttavia, interpretazioni imprecise dei risultati possono derivare da variazioni di parametri quali dimensioni delle celle, contrasto dell’immagine e intensità dell’etichettatura. Questo articolo descrive il nostro protocollo stabilito per quantificare i nuclei cellulari nel cervello del topo. In primo luogo, descriviamo in dettaglio i passaggi per la raccolta dei tessuti del cervello del topo P4, seguiti da un protocollo di pulizia dei tessuti e immunoetichettatura ottimizzato dal metodo iDISCO +¹⁰ disponibile pubblicamente. In secondo luogo, descriviamo l’acquisizione delle immagini utilizzando la risonanza magnetica e la microscopia a foglio leggero, compresi i parametri utilizzati per l’acquisizione delle immagini. Infine, descriviamo e dimostriamo NuMorph¹⁹, una serie di strumenti di analisi delle immagini che il nostro gruppo ha sviluppato che consente la quantificazione specifica del tipo di cellula dopo la pulizia dei tessuti, l’immunomarcatura con marcatori nucleari e l’imaging a foglio luminoso di regioni annotate.

Protocol

Tutti i topi sono stati utilizzati in conformità e approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l’Università della Carolina del Nord a Chapel Hill. 1. Dissezione e perfusione del topo NOTA: Le seguenti dissezioni sono state eseguite su topi P4 e P14 utilizzando una siringa. Il volume del liquido di perfusione varierà a seconda dell’età dell’animale. PerfusioneATTENZIONE: La paraformaldeide (PFA) è una …

Representative Results

Poiché il protocollo iDISCO+ introduce un significativo restringimento tissutale, che è facilmente visibile ad occhio nudo (Figura 2B), abbiamo aggiunto una fase di risonanza magnetica a questa pipeline prima della pulizia dei tessuti per quantificare il restringimento indotto dalla pulizia dei tessuti. Il flusso di lavoro inizia con la rimozione del tessuto non cerebrale dall’immagine MR (Figura 2C). Successivamente, viene applicata una trasformazione rigida …

Discussion

I metodi di pulizia dei tessuti sono tecniche utili per misurare l’organizzazione cellulare 3D del cervello. Ci sono una miriade di metodi di pulizia dei tessuti descritti in letteratura, ognuno con i suoi vantaggi e limiti 6,7,8,9. Le opzioni per gli strumenti computazionali per analizzare i tipi di cellule nelle immagini tessutali sono relativamente limitate. Altri strumenti disponibili sono …

Materials

Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)