Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.
Blaaskanker is een onderbelicht gebied, met name in genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM’s). Inteelt GEMM’s met weefselspecifieke Cre- en loxP-sites zijn de gouden standaard voor voorwaardelijke of induceerbare gentargeting. Om snellere en efficiëntere experimentele modellen te bieden, wordt een ex vivo organoïde kweeksysteem ontwikkeld met behulp van adenovirus Cre en normale urotheelcellen die meerdere loxP-allelen van de tumoronderdrukkers Trp53, Pten en Rb1 dragen. Normale urotheelcellen zijn enzymatisch gescheiden van vier blazen van triple floxed muizen (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). De urotheelcellen worden ex vivo getransduceerd met adenovirus-Cre aangedreven door een CMV promotor (Ad5CMVCre). De getransduceerde blaasorganoïden worden gekweekt, vermeerderd en gekarakteriseerd in vitro en in vivo. PCR wordt gebruikt om gendeleties in Trp53, Pten en Rb1 te bevestigen. Immunofluorescentie (IF) kleuring van organoïden toont positieve expressie van urotheliale afstamming markers (CK5 en p63). De organoïden worden subcutaan geïnjecteerd in gastheermuizen voor tumorexpansie en seriële passages. De immunohistochemie (IHC) van xenografts vertoont positieve expressie van CK7, CK5 en p63 en negatieve expressie van CK8 en Uroplakine 3. Samenvattend is adenovirus-gemedieerde gendeletie uit muizenurotheelcellen die zijn gemanipuleerd met loxP-sites een efficiënte methode om snel het tumorigene potentieel van gedefinieerde genetische veranderingen te testen.
Blaaskanker is de vierde meest voorkomende kanker bij mannen en treft jaarlijks meer dan 80.000 mensen in de Verenigde Staten1. Platina-gebaseerde chemotherapie is al meer dan drie decennia de standaardzorg voor patiënten met gevorderde blaaskanker. Het landschap van de behandeling van blaaskanker is revolutionair veranderd door de recente goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) van immunotherapie (anti-PD-1 en anti-PD-L1 immuuncheckpointremmers), erdafitinib (een fibroblastgroeifactorreceptorremmer) en enfortumab vedotin (een antilichaam-geneesmiddelconjugaat)2,3,4. Er zijn echter geen klinisch goedgekeurde biomarkers beschikbaar voor het voorspellen van de reacties op chemotherapie of immunotherapie. Er is een kritieke behoefte om informatieve preklinische modellen te genereren die het begrip van de mechanismen die de progressie van blaaskanker stimuleren kunnen verbeteren en voorspellende biomarkers voor verschillende behandelingsmodaliteiten kunnen ontwikkelen.
Een belangrijk obstakel in blaastranslationele onderzoeken is het gebrek aan preklinische modellen die de pathogenese en behandelingsresponsen van menselijke blaaskanker samenvatten 5,6. Er zijn meerdere preklinische modellen ontwikkeld, waaronder in vitro 2D-modellen (cellijnen of voorwaardelijk geherprogrammeerde cellen), in vitro 3D-modellen (organoïden, 3D-printen) en in vivo modellen (xenograft, kankerverwekkende, genetisch gemanipuleerde modellen en patiënt-afgeleide xenograft)2,6. Genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM’s) zijn nuttig voor vele toepassingen in de blaaskankerbiologie, waaronder analyses van tumorfenotypen, mechanistisch onderzoek van kandidaatgenen en/of signaalroutes, en de preklinische evaluatie van therapeutische responsen 6,7. GEMM’s kunnen site-specifieke recombinases (Cre-loxP) gebruiken om genetische deleties in een of meer tumorsuppressorgenen te controleren. Het proces van het genereren van gewenste GEMM’s met meerdere gendeleties is tijdrovend, arbeidsintensief en duur5. Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een snelle en efficiënte methode van ex vivo Cre-toediening voor het vaststellen van blaas triple knockout (TKO) modellen van normale muis urotheelcellen met triple floxed allelen (Trp53, Pten en Rb1)8. Het grote voordeel van de ex vivo methode is de snelle workflow (1-2 weken in plaats van jaren muizenfok). Dit artikel beschrijft het protocol voor het oogsten van normale urotheelcellen met gevlokte allelen, ex vivo adenovirustransductie, organoïde culturen en in vitro en in vivo karakterisering bij immunocompetente C57 BL/6J muizen. Deze methode kan verder worden gebruikt om klinisch relevante blaaskankerorganoïden te genereren in immunocompetente muizen die een combinatie van gevlokte allelen herbergen.
GEMM’s zijn de gouden standaard voor kankermodellering geïnitieerd vanuit normale cellen, waardoor de gevolgen van potentiële oncogene verstoringen (oncogenactivering en / of verlies van tumoronderdrukkers) rigoureus kunnen worden getest. Hier wordt een snel en efficiënt protocol aangeboden om blaaskankerorganoïden te genereren via ex vivo genbewerking van normale muis-urotheelcellen die gevlokte allelen dragen in genen van belang. H&E- en IHC-kleuring tonen aan dat TKO-organoïden histologie vertonen die co…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoekswerk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 en R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), de Roswell Park Alliance Foundation en de Friends of Urology Foundation. Wij danken Marisa Blask en Mila Pakhomova voor het proeflezen van het manuscript.
100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
1 mL syringe | BD | 309659 | |
25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 |