Summary

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Published: July 28, 2022
doi:

Summary

Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.

Abstract

Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), die infektiöse Krankheitserreger für Wirbeltiere sind, werden von vielen Mückenarten verbreitet und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Nach der Aufnahme müssen die Viren die Mitteldarmbarriere der Mücken überwinden, um die Hämolymphe zu erreichen, von wo aus sie sich möglicherweise auf die Speicheldrüsen ausbreiten können. Wenn eine Mücke sticht, werden diese Viren auf neue Wirbeltierwirte übertragen. In ähnlicher Weise kann die Mücke verschiedene Viren aufnehmen. In der Regel kann nur ein winziger Teil der Viren über den Darm in die Speicheldrüsen gelangen. Die Übertragungseffizienz dieser Viren auf die Drüsen wird durch die beiden physikalischen Barrieren beeinflusst, die bei verschiedenen Mückenarten zu finden sind: Mitteldarmbarrieren und Speicheldrüsenbarrieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Virusnachweis in Speicheldrüsen von Aedes aegypti nach oraler Nahrungsaufnahme und intrathorakaler Injektionsinfektion dar. Darüber hinaus kann die Feststellung, ob der Darm und/oder die Speicheldrüsen die Virusausbreitung behindern, bei der Risikobewertung von MBVs helfen, die von Aedes aegypti übertragen werden.

Introduction

Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), eine heterogene Gruppe von RNA-Viren, können in Mückenvektoren persistieren und sich anschließend auf Wirbeltierwirte ausbreiten1. Die klinisch bedeutsamen MBVs sind hauptsächlich in vier Virusfamilien verteilt, nämlich Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae und Peribunyavividae 2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden diese Viren auf der ganzen Welt gemeldet und verursachten Probleme für die öffentliche Gesundheit. Als eines der bekanntesten MBVs hat sich das Dengue-Virus (DENV) in den letzten 20 Jahren in über 100 Ländern zum am weitesten verbreiteten neu auftretenden oder wieder auftretenden Arbovirus entwickelt4. Seit der Entdeckung des Zika-Virus (ZIKV) im Landesinneren haben fast alle tropischen und subtropischen Länder und Territorien des Kontinents ZIKV-Infektionen beim Menschen gemeldet5. Um das Risiko einer Virusübertragung abschätzen zu können, haben sich in den letzten Jahren zahlreiche Studien auf die Vektorkompetenz von Stechmücken für diese Viren konzentriert 6,7. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, durch Vektoren übertragene Krankheiten wirksam zu verhindern und zu kontrollieren.

Aedes aegypti (Ae. aegypti), eine der am leichtesten zu züchtenden Stechmücken im Labor, ist ein wichtiger Vektor von DENV, ZIKV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und Gelbfiebervirus (YFV)8. Lange Zeit kam Ae. aegypti nur auf dem afrikanischen Kontinent und in Südostasien vor, hat aber in den letzten Jahren fast alle Kontinente besiedelt9. Darüber hinaus hat die weltweite Häufigkeit von Ae. aegypti kontinuierlich zugenommen, mit einem geschätzten Anstieg von 20 % bis zum Ende des Jahrhunderts10. Von 2004 bis 2009 gab es in China einen deutlichen Anstieg der Ae. aegypti-Vektorkompetenz für DENV aufgrund höherer Tagestemperaturen11. Der Status von Ae. aegypti als pathogener Vektor ist in China deutlich gestiegen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, ist es daher notwendig, die Vektorkompetenz von Ae. aegypti zur Übertragung von Viren zu untersuchen.

Als hämatophager Gliederfüßer durchbohrt die weibliche Stechmücke die Haut eines Wirbeltierwirts und ernährt sich vom Blut. Stechmücken erwerben gelegentlich Viren von virusinfizierten Wirten und übertragen die Viren dann auf einen neuen Wirt. Um die Vektorkompetenz zu bestimmen, werden Stechmücken daher über ein Fütterungssystem in der Laborumgebung mit einem künstlichen Blutmehl gefüttert, das Arboviren enthält12. Einzelne Stechmücken werden einige Tage nach der Infektion in Köpfe, Körper und Speichelsekrete getrennt. Zur Messung der Virusinfektion, -verbreitung und -übertragungsraten wurden Virustiter mittels quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) oder Plaque-Assay nachgewiesen. Allerdings entwickeln nicht alle Mücken Mitteldarminfektionen und die Fähigkeit, ein Virus nach der Blutfütterung auf den nächsten Wirt zu übertragen. Es ist mit den physiologischen Barrieren der Mücken verbunden, die das Eindringen von Krankheitserregern in den Körper verhindern und eine wichtige Rolle für ihre angeborene Immunität spielen13. Die Mitteldarmbarrieren, insbesondere die Mitteldarm-Infektionsbarriere (MIB) und die Mitteldarm-Escape-Barriere (MEB), beeinflussen, ob das Virus den Vektor systemisch infizieren kann und mit welcher Effizienz es sich ausbreitet. Es behindert die Analyse der Infektion anderer Gewebe, wie z. B. Speicheldrüsen, die ebenfalls eine Speicheldrüseninfektion aufweisen, und Fluchtbarrieren13,14. Um die Infektion von Mitteldärmen und Speicheldrüsen im Vektor besser charakterisieren zu können, wird hier ein detailliertes Protokoll für die orale Ernährung und intrathorakale Inokulation von Arboviren bei Ae. aegypti vorgestellt. Dieses Protokoll könnte auf zusätzliche Arbovirusinfektionen in einer Vielzahl von Mückenvektoren angewendet werden, wie z. B. die DENV- und ZIKV-Infektion bei Aedes spp., und könnte sich als praktikables Verfahren erweisen.

Protocol

1. Vorbereitung von Viren und Mücken Präparation von VirenHINWEIS: Alle Prozesse wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Der Grad der verwendeten biologischen Sicherheit sollte durch die Risikobewertung des Erregers und die länder- und regionsspezifischen Vorschriften bestimmt werden. Der Prozess muss in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.1 x 106 C6 /36-Zellen in einen T75-Kulturkolben impfen. Füllen Sie den Kolben mit 10 …

Representative Results

Um die EBIV-Verteilung in den infizierten Stechmücken mittels künstlicher Blutfütterung (der virale Endtiter betrug 6,4 x 106 PFU/ml) und intrathorakaler Injektion (die Virusdosis betrug 340 PFU) zu untersuchen, wurden virale RNAs in Speichel, Kopf und Darm der Mücken 10 Tage nach der Infektion (dpi) bestimmt. Bei Ae. aegypti war der Virustiter von EBIV in den Eingeweiden, Köpfen und im Speichel der intrathorakal inokulierten weiblichen Stechmücken viel höhe…

Discussion

Das Ziel dieser Methode war es, eine umfassende Risikobewertung für ein durch Stechmücken übertragenes Virus zu ermöglichen, indem die Vektorkompetenz durch orale Ernährung und intrathorakale Inokulation bewertet wurde.

Bei dem oralen Fütterungsexperiment müssen die angeschwollenen Mücken herausgesucht und in einen neuen Behälter umgepflanzt werden, was ein ernsthaftes Risiko für die Bediener darstellt. Der Grund dafür ist, dass jede Mücke, einschließlich nicht infizierter Mücken…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501) unterstützt.

Materials

Aedes aegypti  Rockefeller strain
Automated nucleic acid extraction system  NanoMagBio S-48
BHK-21 cells National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Buckets
C6/36 cells  National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Carbon dioxide spray gun  wuhan Yihong YHDFPCO2
Centrifugal machine Himac  CF16RN
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System  Bio-Rad CFX96 Touch
Ebinur Lake virus Cu20-XJ isolation
Formaldehyde  Wuhan Baiqiandu B0003
Glove box 
Glucose Hushi 10010518
Immersion oil  Cargille 16908-1
Insect incubator Memmert HPP750T7
Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine  Servicebio KZ-III-F
Magnetic Virus Genome Extraction Kit NanoMagBio NMG0966-16
mesh cages (30 x 30 x 30 cm) Huayu HY-35
methylcellulose Calbiochem 17851
mice feedstuff powder  BESSN BS018
Microelectrode Puller WPI PUL-1000 PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.
Mosquito net meshes 
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond 3-000-207
One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit  Takara RR096A
PBS, pH 7.4 Gibco C10010500BT
Penicillin/streptomycin Gibco 151140-122
Petri dishes 
Plastic cupes (7 oz)  Hubei Duoanduo
Plastic cups (24 oz)  Anhui shangji PET32-Tub-1
Plastic disposable droppers Biosharp BS-XG-O3L-NS
Refrigerator (-80 °C) sanyo MDF-U54V
Replacement Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
RPMI medium 1640  Gibco C11875500BT
Screw cap storage tubes (2 mL ) biofil  FCT010005
Shallow dishes 
Sponge
Sterile defibrillated horse blood Wuhan Purity Biotechnology CDHXB413
T75 culture flask Corning 430829
The artificial mosquito feeding system  Hemotek Hemotek PS6
The dissecting microscope  ZEISS  stemi508
The ice plates
The mosquito absorbing machine  Ningbo Bangning
The pipette tips  Axygen TF
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Tweezers Dumont 0203-5-PO

References

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Cite This Article
Wang, F., Yang, C., Wang, S., Wu, Q., Ochieng, C., Yuan, Z., Xia, H. Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection. J. Vis. Exp. (185), e63830, doi:10.3791/63830 (2022).

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