Summary

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Published: April 06, 2022
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Summary

Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen und Kapillarperfusion in Echtzeit zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Abbildung und Quantifizierung dieser Parameter im pulmonalen Mikrokreislauf mit einem vakuumstabilisierten Lungenbildgebungssystem.

Abstract

Die intravitale Bildgebung von Leukozyten-Endothel-Interaktionen bietet wertvolle Einblicke in immunvermittelte Erkrankungen bei lebenden Tieren. Die Untersuchung von akuten Lungenverletzungen (ALI) / akutem Atemnotsyndrom (ARDS) und anderen Atemwegserkrankungen in vivo ist aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit und der inhärenten Bewegungsartefakte der Lunge schwierig. Nichtsdestotrotz wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um diese Herausforderungen zu meistern. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur intravitalen Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von Echtzeit-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in der pulmonalen Mikrozirkulation in einem experimentellen Modell von ALI. Ein In-vivo-Lungenbildgebungssystem und eine 3D-gedruckte intravitale Mikroskopieplattform werden verwendet, um die betäubte Maus zu sichern und die Lunge zu stabilisieren, während verwirrende Lungenverletzungen minimiert werden. Nach der Vorbereitung wird die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Leukozytenadhäsion, das Leukozytenrollen und die Kapillarfunktion zu untersuchen. Während sich das hier vorgestellte Protokoll auf die Bildgebung in einem akuten Modell einer entzündlichen Lungenerkrankung konzentriert, kann es auch angepasst werden, um andere pathologische und physiologische Prozesse in der Lunge zu untersuchen.

Introduction

Die intravitale Mikroskopie (IVM) ist ein nützliches bildgebendes Werkzeug zur Visualisierung und Untersuchung verschiedener biophysikalischer Prozesse in vivo. Die Lunge ist aufgrund ihrer geschlossenen Lage, der zerbrechlichen Natur ihres Gewebes und der durch Atmung und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte sehr schwierig in vivo abzubilden 1,2. Verschiedene intravitale Mikroskopie-Setups (IVM) wurden für die Echtzeit-Bildgebung von Leukozyten-Endothel-Interaktionen in der pulmonalen Mikrozirkulation entwickelt, um diese Herausforderungen zu meistern. Solche Ansätze basieren auf der chirurgischen Freilegung und Stabilisierung der Lunge für die Bildgebung.

Tiere werden typischerweise durch chirurgische Eingriffe auf die Lungen-IVM vorbereitet. Zuerst werden die Tiere intubiert und beatmet, was die chirurgische Exzision eines Thoraxfensters und nachfolgende Eingriffe zur Stabilisierung der Lunge für die Bildgebung ermöglicht. Eine Technik besteht darin, das Parenchym auf ein Glasdeckglas3 zu kleben, ein Verfahren, das ein erhebliches körperliches Trauma für das abgebildete Gewebe riskiert. Fortgeschrittener ist die Verwendung eines Vakuumsystems zur Stabilisierung der Lunge unter einem Glasfenster4. Dieser Aufbau erleichtert die lose Haftung der Lungenoberfläche am Deckglas über ein reversibles Vakuum, das über einen großen lokalen Bereich verteilt ist, und dehnt die Lunge aus, während die Bewegung in den x-, y- und z-Dimensionen4 begrenzt wird. Das Vakuum wird gleichmäßig durch einen Kanal aufgetragen, der den Bildgebungsbereich des Aufbaus umgibt, und zieht das Gewebe in einen flachen konischen Bereich, der dem bildgebenden Deckglas4 zugewandt ist. Durch dieses Sichtfenster kann die Mikrozirkulation der Lunge mit verschiedenen optischen Bildgebungsmodalitäten untersucht werden.

Lung IVM ermöglicht die quantitative Bildgebung einer Vielzahl von mikrozirkulatorischen Parametern. Dazu gehören Messungen wie Leukozytenspurgeschwindigkeit und -länge5, Flussgeschwindigkeit der roten Blutkörperchen6 und Oxygenierung7, Tumormetastasen8, die Unterscheidung von Immunzellsubpopulationen 9,10,11, Visualisierung von Mikropartikeln12, Alveolardynamik 13,14, Gefäßpermeabilität 15 und Kapillarfunktion 16 . Der Fokus liegt dabei auf der Leukozytenrekrutierung und Kapillarfunktion. Die Einleitung der Leukozytenrekrutierung in der pulmonalen Mikrozirkulation beinhaltet transiente Rollwechselwirkungen und fest adhäsive Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen, die beide unter entzündlichen Bedingungen erhöht sind16,17. Typischerweise wird das Rollen durch die Anzahl der Leukozyten quantifiziert, die eine vom Betreiber definierte Referenzlinie passieren, während die Adhäsion durch die Anzahl der Leukozyten quantifiziert wird, die auf dem Endothel16 unbeweglich sind. Die Kapillarfunktion kann auch in entzündlichen Zuständen beeinträchtigt sein, was oft zu einer verminderten Perfusion führt. Dies kann auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden, darunter eine Verringerung der Verformbarkeit roter Blutkörperchen18 und eine vielfältige Expression der induzierbaren NO-Synthase durch Endothelzellen, was zu einem pathologischen Rangieren19 führt. Typischerweise wird die Gesamtlänge der perfundierten Kapillaren pro Fläche gemessen und als funktionelle Kapillardichte (FCD) angegeben.

Die Untersuchung der Leukozytenrekrutierung in der Lunge in Echtzeit erfordert die Markierung biologischer Ziele mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszenzmarkierten Antikörpern20. Alternativ können verschiedene transgene Mausstämme wie Lysozym M-grün fluoreszierendes Protein (LysM-GFP) verwendet werden, um spezifische Immunzelluntergruppen wie Neutrophile21,22 abzubilden. Die fluoreszenzmarkierten Leukozyten können dann mittels Weitfeldfluoreszenzmikroskopie, konfokaler Mikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Diese Techniken erreichen Kontrast, indem sie spezifische Anregungswellenlängen verwenden und emittierte Fluoreszenz detektieren, während sie gleichzeitig die Detektion der Anregungswellenlänge blockieren und so das markierte Objekt hervorheben.

Bestehende Forschungen zur Quantifizierung von Leukozytenrollen, Adhäsion und funktioneller Kapillardichte in der murinen Lunge stützten sich hauptsächlich auf die manuelle Videoanalyse. Möglich wird dies durch Open-Source-Software wie Fiji6,23, proprietäre Software wie CapImage12 oder maßgeschneiderte Bildverarbeitungssysteme 24. Umgekehrt ermöglichen verschiedene proprietäre Softwareplattformen (z. B. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) die automatisierte Messung einer Vielzahl anderer physiologischer Parameter, einschließlich vieler der zuvor hier genannten 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Wichtige Beobachtungen wurden in Bezug auf die Pathologie der akuten Lungenschädigung (ALI) und des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) unter Verwendung von Lungen-IVM gemacht. ARDS ist durch eine Vielzahl von pathophysiologischen Prozessen in der Lunge gekennzeichnet, einschließlich Lungenödem und Alveolarschäden, die durch eine Funktionsstörung des Endothels und der Epithelbarriereverursacht werden 25. Unter Verwendung eines murinen Modells wurde festgestellt, dass Sepsis-induzierte ALI mit signifikanten schädlichen Veränderungen des Immunzelltransports in der Lungenumgebung assoziiert ist26. Es wurde festgestellt, dass Neutrophile, die in den Kapillaren von Mäusen mit Sepsis-induziertem ALI rekrutiert wurden, die Mikrozirkulation behindern und dadurch die Hypoxie bei ALI26 erhöhen. Darüber hinaus wurde IVM verwendet, um Einblicke in den zugrunde liegenden Reparaturmechanismus nach dem Einsetzen von ARDS27 zu gewinnen. Die Lungen-IVM war auch ein wertvolles Werkzeug zum Verständnis pathophysiologischer Veränderungen bei verschiedenen obstruktiven Lungenerkrankungen. Zum Beispiel hat die Visualisierung des Schleimtransports bei Krankheiten wie Mukoviszidose (CF) und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) die Untersuchung neuartiger und bestehender Behandlungen für die Schleimentfernungerleichtert 28. Der Leukozytenhandel unter diesen Bedingungen wurde ebenfallsanalysiert 17.

Dieses Protokoll erweitert den ursprünglich von Lamm et al.29 beschriebenen Ansatz, Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen unter Verwendung herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Die beschriebenen Verfahren verwenden ein In-vivo-Lungenbildgebungssystem , das eine 16,5 cm x 12,7 cm große Metallbasis, einen Mikromanipulator und ein Vakuumbildgebungsfenster umfasst (Abbildung 1). Das System ist in einer 20 cm x 23,5 cm großen 3D-gedruckten Plattform (Supplemental File 1) montiert, um eine sichere Befestigung für den Ventilatorschlauch und das Heizkissen zu gewährleisten. Diese Methode bietet eine reproduzierbare und quantifizierbare Bildgebung der murinen pulmonalen Mikrozirkulation in vivo. Wichtige Aspekte der chirurgischen Vorbereitung sowie der ordnungsgemäße Einsatz eines vakuumstabilisierten Lungenbildgebungssystems werden ausführlich erläutert. Schließlich wird ein experimentelles Modell von ALI verwendet, um eine repräsentative Bildgebung und Analyse des veränderten Leukozytenrollens, der Leukozytenadhäsion und der Kapillarperfusion im Zusammenhang mit Entzündungen bereitzustellen. Die Verwendung dieses Protokolls soll weitere wichtige Untersuchungen zu pathophysiologischen Veränderungen der pulmonalen Mikrozirkulation während akuter Krankheitszustände erleichtern.

Protocol

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden mit vorheriger Genehmigung des Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA) durchgeführt. 1. Vorbereitung Lungenbildgebungssystem: Um das Fenster vorzubereiten, verabreichen Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf die Oberseite des äußeren Rings, während eine Kontamination des Vakuumkanals vermieden wird. Legen Sie einen sauberen 8 mm Glasabzug auf das Fenster und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, um ei…

Representative Results

Um die durch dieses Protokoll erreichbaren Ergebnisse zu veranschaulichen, wurde die akute Lungenverletzung (ALI) 6 h vor der Bildgebung unter Verwendung eines Modells der intranasalen bakteriellen Lipopolysaccharid-Instillation (LPS) induziert. Kurz gesagt, Mäuse (n = 3) wurden mit Isofluran betäubt, und kleine Tröpfchen von LPS aus Pseudomonas aeruginosa in steriler Kochsalzlösung (10 mg / ml) wurden in einer Dosierung von 5 mg / kg in die linke Naris pipettiert. Dies wurde mit naiven Mäusen verglichen (n…

Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll erfordert Übung und Aufmerksamkeit für einige kritische Schritte. Zunächst ist es wichtig, das Bildgebungsfenster vor Beginn der Intubation und Operation vorzubereiten. Verwenden Sie eine minimale Menge an Vakuumfett, um den äußeren Ring des Bildfensters zu beschichten, tragen Sie das Deckglas auf und testen Sie die Absaugung mit einem Tropfen destilliertem Wasser. Wenn Sie dies im Voraus vorbereiten, wird verhindert, dass die exponierte Lunge während des Setups austrocknet. Während…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Pina Colarusso, die bei der Bearbeitung und Überarbeitung dieses Manuskripts eine bedeutende Expertise zur Verfügung gestellt hat.

Materials

1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use Becton, Dickinson and Company 309659 1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm RWD Life Science Co. F12002-12 Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate Sigma-Aldrich A9771-1G FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v Canadian Custom Packaging Company 80002455 Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter Canopus 00631069602029 Digital video converter
B/W – CCD – Camera Horn Imaging BC-71 Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit Fine Science Tools 18010-00 Cauterizer
C57BL/6 Mice Charles River Laboratories International C57BL/6NCrl C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators Puritan 806-WC Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip Warner Instruments 64-0701 Glass coverslip
Digital Pressure Gauge ITM Instruments Inc. DG2551L0NAM02L0IM&V Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope Dr. Mom Otoscopes 1001 Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol Commercial Alcohols P016EA95 95% ethanol
Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel Fine Science Tools 14094-11 Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape Fisher Scientific 1590110 Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump Cole-Parmer Canada Company ZA-07061-40 Vacuum pump
Hartman Hemostats Fine Science Tools 13003-10 Hemostatic forceps
High Vacuum Grease Dow Corning DC976VF Vacuum grease
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2 Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL Teligent Canada 0121AD01 Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard Luxidea, Inc. IMCH-0001 Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil Teva Canada 00485802 Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit Kent Scientific Corporation ETI-MSE Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope Leica Microsystems 10 450 022 Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective Leica Microsystems 566035 20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2" AMD-Ritmed A2101-CH Gauze
Optixcare Eye Lube Plus Aventix 5914322 Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer Prusa Research PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI 3D printer
Oxygen, Compressed Linde Canada Inc. Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) Becton, Dickinson and Company 305106 30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL Cole-Parmer Canada Company 5340-2L Vacuum flask
Rhodamine 6 G Sigma-Aldrich 252433 Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" Primed PM5-630709 Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD Dow Corning 602-205 1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01, SS-04-module Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth World Precision Instruments 501216 Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) 3M 7000002795 Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. Grainger Canada USSZUSA-HT3314 1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm Cole-Parmer Canada Company 6720-5002 Inline 0.2µm filter

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Hall, S., Faridi, S., Euodia, I., Tanner, S., Chojnacki, A. K., Patel, K. D., Zhou, J., Lehmann, C. Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System. J. Vis. Exp. (182), e63733, doi:10.3791/63733 (2022).

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