用于研究喉移植的异位小鼠模型
Summary
本手稿的目的是描述在小鼠中进行异位喉移植所需的显微外科步骤。与其他喉移植动物模型相比，该小鼠模型的优势在于其成本效益以及免疫学测定和数据的可用性。
Abstract
喉异位移植虽然在技术上具有挑战性，但与其他动物模型相比，它提供了更多的科学分析和成本效益。虽然Shipchandler等人在2009年首次描述了这项技术，但这种技术并未被广泛使用，可能是由于学习显微外科技术的困难和掌握它所需的时间。本文详细描述了手术步骤，以及需要避免的潜在陷阱，以鼓励有效使用该技术。
在该模型中，供体喉的双侧颈动脉与受体颈动脉和颈外静脉吻合，允许血液流经移植物。术中可通过观察移植物双侧颈动脉充血、移植物甲状腺变红以及移植物微血管出血来确认血流。成功的关键因素包括精细保存移植血管，进行正确大小的动脉切开术和静脉切开术，以及在动脉-动脉和动脉-静脉吻合上使用适当数量的缝合线，以固定血管而不会渗漏并防止闭塞。
任何人都可以通过足够的培训精通该模型，并在大约 3 小时内执行该过程。如果成功执行，该模型可以轻松且低成本地进行免疫学研究。
Introduction
对于患有无法修复的喉损伤或喉癌的患者，全喉切除术通常是唯一的选择1.全喉切除术使患者除了经历社会和心理困扰外，还无法自行呼吸和说话2.需要全喉切除术的喉癌患者是喉移植的绝佳潜在候选人。虽然已经在喉损伤无法弥补的情况下进行了人喉移植，但由于担心肿瘤复发、慢性排斥反应的可能性和供体来源的感染，目前这些患者避免进行喉部同种异体移植3。免疫抑制是这些问题的主要原因。常规免疫抑制治疗后，首例部分喉移植患者因肿瘤复发而急剧丢失，这证明在喉癌患者进一步尝试移植之前，应设计适当的免疫抑制方案4，5。
为了更好地了解宿主对移植喉的免疫反应，Strome于1992年开发了第一个大鼠喉移植模型，并于2002年对手术技术进行了改进6，7。尽管该模型对研究喉移植有效，但由于缺乏大鼠特异性免疫制剂以及与大鼠模型相关的较高成本，导致在2009年开发了用于研究喉移植的新小鼠模型8。
所述技术的主要应用是研究喉移植中的不同免疫抑制药物方案。改善目前的免疫抑制疗法可能会扩大候选库，并导致癌症患者的安全移植。该小鼠模型的优点是其成本效益以及免疫学数据和试剂的广泛可用性。
研究喉移植免疫抑制治疗方案的团队可以使用这种方法收集大量的免疫学数据，并且可以快速测试和比较不同的药物方案。其他可以调节对移植免疫反应的潜在治疗方式，例如干细胞注射，也可以使用该模型进行测试。最后，可以通过延长随访期来观察喉移植的长期全身效应。
这里描述的技术使用端对侧吻合为异位喉移植物提供动脉和静脉血流。移植物是一种喉气管食管 （LTE） 复合体，包括供体的喉、甲状腺、甲状旁腺、气管和食道，双侧颈动脉和椎弓根完好无损。一条供体颈动脉吻合到受者颈动脉并提供动脉血流，而另一条供体颈动脉与受体颈外静脉吻合并提供静脉血流（图1）。
对大鼠模型的手术技术进行了一些修改，以确保小鼠模型的成功。例如，使用吸入麻醉剂代替注射剂，以增加对麻醉深度的控制并减少并发症。连续缝合用于大鼠的动脉 – 动脉吻合术;然而，由于小鼠血管的尺寸较小，这在技术上是困难的，并且可能导致血管管腔7变窄。因此，在小鼠模型中使用中断缝合线，并改善血管通畅性。此外，在大鼠模型中，甲状腺上动脉（STA）椎弓根被解剖并可视化。鉴于小鼠中STA的尺寸较小，这种解剖可能导致STA的损伤甚至横断。因此，它不会在鼠标模型中剖析。相反，附近的筋膜被保留以确保 STA 保持完整。
该技术的主要潜在缺陷包括损坏供体LTE复合椎弓根，进行尺寸不正确的动脉切开术或静脉切开术，吻合部位的血管闭塞或在吻合部位留下可能导致出血的间隙。为避免这些失误，在获取供体移植物时必须小心，在STA椎弓根周围留下一束组织。动脉切开术和静脉切开术应足够大以允许血液流动，但又应足够小以防止渗漏。吻合缝应使用适当数量的缝合线以缝合任何间隙，但不要太多以阻塞血管。
如果熟悉显微外科技术，该过程可以在大约3小时内进行。这种喉移植模型可以在小鼠中可靠地进行，并用于研究血管化复合同种异体移植后的宿主免疫反应。
Protocol
Representative Results
Discussion
在过去的三十年中，喉癌的发病率和患病率分别增加了12%和24%，其中许多患者接受了喉切除术进行治疗10。这种手术会显着恶化一个人的生活质量，因此需要替代治疗。喉部血管化复合同种异体移植可以改善患者的呼吸和说话能力;然而，在该技术可用于临床上该患者群体之前，仍需要进行研究。本文提供了一种具有成本效益的喉移植小鼠模型，可以研究各种免疫抑制方案。
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Randall Raish出色的摄像和编辑协助。
Materials
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
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