Summary

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

Published: June 17, 2022
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Summary

レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。

Abstract

急性骨髄性白血病(AML)患者の耐性を回避し、生存率を改善する方法を解明するためには、後天性化学抵抗性の臨床的に関連するドライバーメカニズムを理解することが不可欠です。化学療法を生き延びた白血病細胞のごく一部は、化学療法的侮辱に耐えうるエピジェネティックな状態にある。化学療法へのさらなる曝露は、これらの薬物持続細胞が固定エピジェネティック状態を達成することを可能にし、これは遺伝子発現の変化をもたらし、これらの薬物耐性集団の増殖をもたらし、最終的には再発または難治性疾患をもたらす。したがって、薬剤耐性白血病細胞の生存を必要とするエピジェネティックな変調を同定することは極めて重要である。我々は、ヌクレオシド類似体シタラビン(AraC)に対する耐性を媒介するエピジェネティックモジュレーターを同定するためのプロトコルを、獲得シタラビン耐性AML細胞株におけるプールされたshRNAライブラリースクリーニングを用いて詳述する。このライブラリーは、407のヒトエピジェネティック因子を標的とする5,485のshRNAコンストラクトで構成されており、ハイスループットのエピジェネティック因子スクリーニングを可能にします。

Introduction

急性骨髄性白血病(AML)の治療選択肢は、シタラビン(AraC)とアントラサイクリンをこの疾患を治療するための礎石として、過去50年近く変わっていません。AML療法の成功に対する課題の1つは、化学療法に対する白血病幹細胞の耐性であり、疾患の再発につながる1,2。エピジェネティックな調節は、がんの病因および薬剤耐性において重要な役割を果たしており、いくつかのエピジェネティックな因子が有望な治療標的として浮上している3,4,5エピジェネティックな調節機構は、化学療法薬への継続的な曝露下での増殖および生存に影響を及ぼす。非血液学的悪性腫瘍における研究は、薬物効果を克服する細胞のごく一部が様々なエピジェネティクス修飾を受け、それらの細胞の生存をもたらすことを報告している6,7。しかしながら、AMLにおけるシタラビンに対する後天性耐性を媒介するエピジェネティック因子の役割は、探求されていない。

ハイスループットスクリーニングは、時間の経過とともに世界的に重要性を増してきた創薬へのアプローチであり、細胞メカニズム、経路プロファイリング、および分子レベルで潜在的な標的を同定するためのさまざまな側面で標準的な方法となっています8,9。合成致死性の概念は、どちらかの遺伝子のみの摂動が実行可能であるが、両方の遺伝子の同時実行可能性の喪失をもたらす2つの遺伝子間の相互作用を含む10。がん治療における合成致死性を利用することは、堅牢な合成致死的遺伝的相互作用を特定し、機械的に特徴付けるのに役立つ可能性がある11。我々は、AMLにおける後天性シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子を同定するために、合成致死性を有するハイスループットshRNAスクリーニングのコンビナトリアルアプローチを採用した。

混合系統白血病遺伝子(MLL または KMT2A)の染色体転座によって引き起こされる急性白血病は、患者の生存率の低下と関連していることが知られている。得られたMLL遺伝子再構成のキメラ産物、すなわちMLL融合タンパク質( MLL-FP )は、造血幹/前駆細胞(HSPC)を複数のエピジェネティック因子の関与により白血病芽細胞に変換することができる。これらのエピジェネティックな調節因子は、白血病プログラムの維持を指示する複雑なネットワークを構成し、したがって、潜在的な治療標的を形成する可能性がある。この文脈で、我々はMV4-11細胞株(FLT3-ITD変異を有するMLL融合遺伝子MLL-AF4を保有し、MV4-11Pと称される)を用いて、MV4-11 AraC Rとして知られる後天性シタラビン耐性細胞株を開発した。細胞株は、薬物の休日として知られている薬物治療からの断続的な回復を伴うシタラビンの用量の増加に曝露された。半最大阻害濃度(IC50)を インビトロ 細胞傷害性アッセイにより評価した。

我々は、pZIPレンチウイルス骨格を有するhEF1aプロモーターによって駆動されるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリー( 材料表を参照)を使用した。このライブラリーは、407のエピジェネティック因子を標的とするshRNAを含む。各因子には5~24個のshRNAがあり、5個の非標的対照shRNAを含む合計5,485個のshRNAがあります。修飾された「UltrmiR」miR−30スキャフォールドは、効率的な一次shRNA生合成および発現1213のために最適化されている。

この実験の概要を 図1Aに示します。現在のプロトコルは、浮遊細胞株であるMV4-11 AraC R細胞株(図1B)におけるエピジェネティック因子shRNAライブラリーを用いたRNAiスクリーニングに焦点を当てています。このプロトコルは、任意の薬剤耐性細胞株中の任意の標的ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。形質導入プロトコルは、接着細胞について異なるであろうことに留意されたい。

Protocol

インスティテューショナルバイオセーフティ委員会(IBSC)のガイドラインに従い、レンチウイルス(BSL-2)を処理するために適切な施設を使用してください。担当者は、レンチウイルスの取り扱いと処分について適切な訓練を受けるべきです。このプロトコルは、クリスチャン医科大学、ヴェローレのバイオセーフティガイドラインに従います。 1. shRNAの持続的かつ長期?…

Representative Results

スクリーニングワークフロー全体を図1Aに示します。MV4−11 AraC Rのインビトロ細胞傷害性(48時間)は、MV4−11 AraC R中のシタラビンに対するIC50がMV4−11 Pよりも高いことを明らかにした(図1B)。この細胞株を、シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子をスクリーニングするためのモデルとして研究に使用した。 <p class=…

Discussion

RNA干渉(RNAi)は、siRNAおよびshRNAスクリーニングを含む機能ゲノミクス研究に広く使用されている。shRNAの利点は、それらをプラスミドベクターに組み込んでゲノムDNAに組み込むことができ、安定した発現をもたらし、したがって標的mRNAのより長期のノックダウンをもたらすことである。プールされたshRNAライブラリースクリーニングは、従来のアレイスクリーニング(siRNA)と比較して堅牢で費用…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、バイオテクノロジー省の助成金BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013からSRVへの資金提供を受けています。インドバイオテクノロジー省BT/COE/34/SP13432/2015およびインド科学技術省:EMR/2017/003880からP.B. RVSおよびP.B.は、それぞれWellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118およびIA/S/15/1/501842によってサポートされています。S.D.はCSIR-UGCフェローシップによって支援され、S.I.はICMRシニアリサーチフェローシップによってサポートされています。Abhirup Bagchi、Sandya Rani、CSCR Flow Cytometry Core Facilityのスタッフの協力に感謝します。また、ハイスループットシーケンシングとデータ解析を支援してくれたMedGenome Inc.にも感謝します。

Materials

Reagents
100 bp Ladder Hyper Ladder BIOLINE BIO-33025
1kb Ladder Hyper Ladder BIOLINE BIO-33056
Agarose Lonza Seachekm 50004
Betaine (5mM) Sigma B03001VL
Boric Acid Qualigens 12005
Cell culture plasticware Corning as appicable
Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride Sigma C1768-500MG
DMEM MP BIO 91233354
DMSO Wak Chemie GMBH Cryosure DMSO 10ml
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide Sigma E1510-10 mL
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044
Gel/PCR Purification Kit MACHEREY-NAGEL REF 740609.50
Gibco- RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 23400021
Glacial Acetic Acid Thermo Q11007
hCMV GFP Plasmid Transomics TransOmics Promoter selection KIT
hEF1a GFPlasmid Transomics TransOmics Promoter selection KIT
HEK 293T ATCC CRL-11268
HL60 cell line ATCC CCL-240
KOD Hot Start Polymerase Merck 71086
Molm13 cell line Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA
MV4-11 cell line ATCC CRL-9591
Penicillin streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
psPAX2 and pMD2.G Addgene Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen REF Q32854
SFFV  GFP Plasmid Transomics TransOmics Promoter selection KIT
shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics Transomics Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14
Trans-IT-LTI Mirus Mirus Mirus Catalog Number: MIR2300
Tris MP Biomedicals 0219485591
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154-100ML
Ultra centrifuge Tubes Beckman Coulter  103319
Equipments
5% CO2 incubator Thermo Fisher
BD Aria III cell sorter Becton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation Beckman coulter
Centrifuge Thermo Multiguge 3SR+
ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) Fluro Chem
Leica AF600 Leica
Light Microscope Zeiss Axiovert 40c
Nanodrop Thermo Scientific
Qubit 3.0 Fluorometer Invitrogen
Thermal Cycler BioRad

References

  1. Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
  3. Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
  4. Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
  5. Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
  6. Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
  7. Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
  8. Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
  9. Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
  10. O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
  11. Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
  12. Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
  13. Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
  14. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  15. Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
  16. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).

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Cite This Article
Das, S., Stallon Illangeswaran, R. S., Ijee, S., Kumar, S., Velayudhan, S. R., Balasubramanian, P. Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype. J. Vis. Exp. (184), e63383, doi:10.3791/63383 (2022).

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