여기에서는 표면 사구체가있는 뮌헨 Wistar Fromter 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 사구체 역학 및 기능에 대한 장기간의 요관 폐쇄의 영향을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다.
신장의 동적 생리학을 탐구하기 위해 적합한 동물 질병 모델에 새로운 현미경 방법을 적용하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 표면 사구체를 가진 쥐는 생체 내 2 광자 현미경을 사용하여 생리 학적 및 병리 생리 학적 과정을 조사 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 사구체 모세 혈관 혈류의 정량화와 약물, 투과성 및 염증에 대한 반응의 혈관 수축 및 확장은 연구 할 수있는 과정 중 일부일뿐입니다. 또한, 형질전환 래트, 즉 형광 염료 및 기타 분자 바이오마커 접근법으로 표지된 족세포는 단백질-단백질 상호작용 및 특정 분자 변화의 영향을 직접 모니터링하고 정량화하기 위해 증가된 분해능을 제공합니다.
생후 4 주 후에 표면 사구체가 부족한 마우스에서는 몇 주 동안 일방적 인 요관 폐쇄 (UUO)를 사용하여 표면 사구체를 유도했습니다. 이 유도 모델은 기준 연구를 허용하지 않기 때문에 생리학적 조건에서 표면 사구체를 갖는 뮌헨 Wistar Frömter(MWF) 쥐의 UUO 모델에서 사구체 과정에 대한 UUO의 영향을 정량화했습니다. 5 주 이상 동안 UUO 모델은 총 신장 형태, 관상 주위 및 사구체 미세 혈관계, 세뇨관 상피의 구조 및 기능에 상당한 변화를 유도했습니다. 사구체 및 관주위 적혈구(RBC) 흐름이 유의하게 감소했는데(p < 0.01), 아마도 사구체 및 관주위 모세혈관 내에서 백혈구(WBC)의 부착이 크게 증가했기 때문일 것입니다. 알부민의 사구체 체질 계수는 처리되지 않은 MWF에서 0.015± 0.002에서 5 주 된 UUO MWF 쥐에서 0.045 ± 0.05로 증가했습니다. 12주간의 UUO는 알부민에 대한 표면 사구체 밀도와 사구체 체질 계수(GSC)의 추가 증가를 가져왔습니다. 사구체를 가로질러 여과된 형광 알부민은 근위 세뇨관에 의해 재흡수되지 않았다. 이러한 데이터는 UUO를 사용하여 표면 사구체를 유도하면 정상적인 사구체 과정과 질병 변화를 연구하고 해석하는 능력이 제한된다는 것을 시사합니다.
사구체 과정, 특히 족세포 생물학을 이해하는 것은 50 년 넘게 목표였습니다. 표면 사구체를 가진 뮌헨 Wistar 쥐는 생리학적 및 병리학적 과정의 다양한 측면을 이해하기 위해 미세 천자 연구를 포함한 이러한 연구에서 중심적인 역할을 했습니다1,2,3. 사구체 구성 요소를 생체 내에서 연구하기위한 현미경의 활용은이 독성 노출을 최소화하고 침투 깊이 1,2를 증가시키는 2 광자 현미경의 출현까지 광독성의 영향으로 인해 제한되었습니다. 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 급속한 발전과 함께, 이것은 단일 설정 1,4,5에서 몇 시간 동안 3 차원 (3D) 및 4 차원 (시간) 연구를 가능하게했습니다.
사구체 모세 혈관 혈류의 정량화, 약물에 대한 반응의 혈관 수축 및 확장, 투과성 및 투과성 및 염증에 대한 전하의 영향은 연구 된 사구체 과정 중 일부일뿐입니다. 또한, 근위 세뇨관의 S1 세그먼트를 식별 할 수 있으며, S1 및 S2 관상 상피의 거동 차이를 정량화 할 수 있습니다 1,4. 마우스에 대한 연구, 특히 마우스 형질 전환 시설의 보편적 이용 가능성으로 인해 사구체 질환 과정의 분자 생물학에 대한 이해가 급속히 발전했습니다. 개별 단백질은 녹아웃 연구, 특히 단백뇨 6,7,8과 관련하여 사구체 기능 장애를 담당합니다. 그러나 사구체 영상 연구를 위한 마우스 모델의 활용은 연구된 수많은 균주에서 사구체가 표면 아래 100μm 이상이기 때문에 제한적이었습니다9.
이로 인해 연구자들은 마우스 모델을 개발하고 활용하여 연구 할 수있는 표면 사구체를 생성하게되었습니다. 가장 일반적인 모델은 완전한 UUO10,11,12를 사용하는 것입니다. 연장 된 UUO 기간이 끝나면 생쥐 신장에는13,14 번 연구 될 수 있고 연구 된 수많은 표면 사구체가 있습니다. 이러한 마우스 연구에서 사구체 생물학에 대한 연장된 UUO의 효과를 결정하기 위한 기준선 또는 대조 연구는 없었습니다. 이것은 빠른 섬유증과 피질 파괴10,11,12를 초래하는 심각하고 장기간의 손상 모델이기 때문에 사구체 과정과 기능에 영향을 미칠 것이라는 가설을 세웠습니다. 이 질문에 답하기 위해 표면 사구체를 가진 뮌헨 Wistar Fromter (MWF) 쥐를 사용하여 대조군 / 기준선 매개 변수를 연구하고 기준선 결과를 UUO 5 주 후 MWF 쥐의 사구체 연구와 비교했습니다. 우리는 또한 UUO 다음에 표면 사구체가없는 Sprague Dawley (SD) 쥐를 연구했습니다. 연구 결과는 MWF 및 SD 쥐에서 5 주간의 UUO가 실제로 표면 사구체의 수를 증가 시킨다는 것을 나타냅니다. 그러나 이들은 사구체 혈류, 염증, 거대분자 투과성 및 크기의 현저한 변화를 가진 비정상적인 사구체였습니다.
사구체 생리학에 대한 연구는 다양한 접근법, 특히 미세 천자의 사용, 분리 된 사구체의 관류 및 현미경 검사를 보았습니다. 뮌헨 Wistar 래트, Fromter 및 Simonsen 균주에서 표면 사구체의 가용성은 생체 내 동적 연구를 허용했습니다. 이 기술을 채택하는 연구자에게 한 가지 중요한 참고 사항은 연구 간에 일관된 이미지를 유지하기 위해 획득 매개변수를 설정해야 하므로 조직의 자가형광이 일관되게 유지된다는 것입니다. 이중 패스 플루오레세인/로다민 에피형광 큐브를 활용하고 게인 설정을 녹색 및 적색 방출 채널로 조정하여 접안렌즈를 통해 보이는 것을 컴퓨터 화면에서 모방하면 서로 다른 현미경 시스템 간에도 자가형광에서 일관된 색상 서명을 보장할 수 있습니다.
Fromter 균주는 총 사구체 수가 감소하고 ~75%가 정상이며 수컷은 약 12주령에 자발적으로 고혈압이 발생하여 진행성 단백뇨 및 후속 국소 사구체 경화증과 함께 결국 신부전으로 사망하기 때문에 광범위하게 사용되었습니다12. 이 쥐의 사용과 광독성 감소, 침투 깊이 개선 및 여러 형광 프로브를 동시에 볼 수있는 능력을 갖춘 2 광자 현미경의 추가는 새로운 발견 1,4,5를위한 길을 열었습니다. 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 개발로 정량적 데이터는 이제 모든 2 광자 실험실의 표준이되었습니다. 여러 정량적 기술이 개발되어 생리학적 및 질병 상태 1,4,5,27,28,29,30 하에서 사구체, 근위 세뇨관, 혈관 및 간질 과정에 적용되었습니다.
트랜스제닉 마우스 생성 시설은 신장 생리학 및 병리학 연구에 새로운 차원을 추가했으며, 이를 2광자 현미경과 결합하여 신장 구조 및 기능에서 특정 유전자 산물의 중요성을 더욱 설명할 때까지는 시간 문제였습니다. 그러나, 마우스 사구체는, 아주 어린 마우스를 제외하고, 신장의 표면으로부터 100 μm 이상 위치한다9. 2광자 현미경은 분해능으로 20μm에서 50μm 사이의 깊이에서 수행하는 것이 가장 좋으며, 방출된 빛의 산란 및 헤모글로빈과의 상호 작용으로 인한 흡수로 인해 형광 강도가 급격히 감소합니다. 따라서, 표면 사구체를 유도할 필요가 있었다. 일반적으로 사용되는 접근법은 12 주 동안 장기간 일방적 인 방해 모델입니다. 이러한 모델은 기준선 결정을 허용하지 않기 때문에 연구중인 프로세스에서 UUO의 효과를 분리 할 수 없습니다.
MWF 쥐를 사용하여 기준선 사구체 기능을 UUO 이후의 기능과 비교할 수 있습니다. 이 UUO 모델은 염증과 빠른 섬유증 속도를 유도하는 것으로 알려져 있으며 CKD 및 섬유증10,11,12를 연구하는 데 사용되었습니다. 예상대로, MWF와 SD 래트 모두에서 표면 사구체가 증가했다. 더욱이, MWF 및 SD 래트에 대한 UUO 이후에 얻어진 정량적 결과는 매우 유사했다. 여기에 기록된 혈류의 감소는 UUO 이후의 현미경 데이터와 미세 천자 데이터3을 비교한 적이 있습니다. 또한 관상 및 간질 조직학이 현저하게 변경되고 PT는 여기에보고 된 바와 같이 알부민 세포 내 이입이 부족하여 대부분 기능하지 않는다는 것이 잘 알려져 있습니다. 그림 2와 그림 3의 연구는 사구체 및 관주위 모세혈관에서 RBC 유속의 극적인 감소와 향상된 WBC 접착력을 보여줍니다. 흐름의 감소는 WBC 접착 및 룰로 형성으로 인한 모세관 막힘으로 인한 것일 수 있습니다.
염증을 더 평가하기 위해 알부민 투과성을 정량화하고 10 배 증가하는 것으로 나타났습니다. 추가로, 단리된 사구체는 다양한 신장 질환 상태에서 신장 염증에서 증가하는 것으로 이전에 알려진 많은 유전자에 대해 mRNA 발현이 증가한다는 것을 보여주었다 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . 사구체 표면 밀도와 알부민 투과성의 증가는 12 주 UUO 데이터에서 볼 수 있듯이 점진적이었습니다. 본 데이터는 사구체가 UUO 모델에서 상당한 구조적 손상, 염증 및 분자 변화를 겪는다는 것을 직접 보여주는 최초의 데이터입니다. 결과는 UUO 후 양 신장 생검을 분석 한 전체 신장 조직에 대한 초기 연구와 일치하여 여러 염증 마커가19 상승한 것으로 나타났습니다. 본 결과는 이전에 피질 조직에 대해서만 알려진 사구체 내에 현저한 염증이 존재함을 나타냅니다.
본 데이터는 12주 수신과 정상 사구체 사이의 접착 분자 발현, 보체 침착 및 호중구 침윤에서 변화가 발견되지 않은 마우스의 이전 연구와 다릅니다31. 또한 Hickey 실험실은 12 주 UUO 모델을 사용하여 생쥐의 사구체에서 면역 반응을 연구했습니다. 그들은 4 주 된 마우스 사구체와 폐쇄 후 사구체32,33 사이의 호중구 침윤에 차이가 없음을 발견했습니다. 이 후기 연구는 막힌 신장의 골반에서 소변을 배출 한 후에 수행되었습니다. 우리는 UUO가 사구체 기능에 미치는 영향을 인위적으로 제거하지 않고 생체 내에서 사구체 기능에 미치는 영향을 결정하고 싶었 기 때문에이를 수행하지 않았습니다. 마지막으로, 마우스에서 UUO의 사용은 표면 아래 100 μm 이상에서 사구체를 이미징하는 것으로 대체되고 있습니다. 가능한 한, 해상도와 강도의 절충이 있으며, 둘 다 50 μm34를 초과함에 따라 크게 감소합니다.
제시된 결과는 조직 학적 변화, 무관 사구체의 형성, 염증, 섬유증, 혈역학10,11,12에 관한 기존 문헌의 데이터를 함께 모으는 것은 놀라운 일이 아닙니다. WBC 접착, 룰로 형성, 사구체 분자 염증 마커 및 알부민 투과성 증가를 포함하여 제시된 데이터는 이 UUO 모델에서 5주에도 진행 중이며 12주에도 존재하는 광범위한 염증을 추가로 나타냅니다. 분명히, 만성 UUO는 생리적 상태가 아니며, 표면 사구체를 유도하기 위해 UUO를 사용하는 것은 손상 모델을 나타냅니다. 생리적 조건 하에서 표면 사구체를 갖는 MWF 쥐는 손상이 발생할 때 종단적으로 연구될 수 있다. 형질 전환 쥐를 생성하는 것이 가능하며 수많은 연구자들이 특정 질문을하기 위해 바이오 센서로 쥐를 만들고 있습니다. 특히, 위스콘신 의과 대학은 현재 MWF 쥐의 식민지를 가지고 있으며 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 사구체 과정을 연구 할 목적으로 형질 전환 쥐를 만들었습니다. 이 MWF 쥐는 정상, 질병 및 유 전적으로 변형 된 쥐의 사구체 과정을 연구 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 보조금 RO1DK091623 및 P30DK079312(BAM에)의 지원을 받았습니다. 나노스트링 분석을 수행한 미시간 주립 대학의 연구 기술 지원 시설(RTSF)의 유전체학 핵심 시설 직원에게 감사드립니다.
70 µm sterile cell strainer | Corning | #421751 | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | #421752 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
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Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Cat# 78266-04 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Quant-iT RNA Assay Kit | Invitrogen/ThermoFisher | Q33140 | |
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Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |