Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.
Abstract
Entzündliche Caspasen umfassen Caspase-1, -4, -5, -11 und -12 und gehören zur Untergruppe der Initiator-Caspasen. Caspase-1 ist erforderlich, um eine korrekte Regulation der Entzündungssignale zu gewährleisten und wird durch näherungsinduzierte Dimerisierung nach der Rekrutierung zu Inflammasomen aktiviert. Caspase-1 ist in der monozytären Zelllinie reichlich vorhanden und induziert die Reifung der entzündungsfördernden Zytokine Interleukin (IL)-1β und IL-18 zu aktiven sezernierten Molekülen. Die anderen entzündlichen Caspasen, Caspase-4 und -5 (und ihre murine homologe Caspase-11) fördern die IL-1β-Freisetzung durch Induktion von Pyroptose. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) ist ein Werkzeug zur Messung der entzündlichen Caspase-induzierten Nähe als Auslesung der Caspase-Aktivierung. Die Caspase-1-, -4- oder -5-Prodomain, die die Region enthält, die an das Inflammasom bindet, ist mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des gelben fluoreszierenden Proteins Venus (Venus-N [VN] oder Venus-C [VC]) verschmolzen, die sich mit der Reform des fluoreszierenden Venuskomplexes verbinden, wenn die Caspasen induzierte Nähe erfahren. Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Reporter mittels Nukleofektion in primäre humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (MDM) eingeführt werden, die Zellen behandeln, um eine entzündliche Caspase-Aktivierung zu induzieren, und die Caspase-Aktivierung mittels Fluoreszenz und konfokaler Mikroskopie messen. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er verwendet werden kann, um die Komponenten, Anforderungen und Lokalisation des entzündlichen Caspase-Aktivierungskomplexes in lebenden Zellen zu identifizieren. Es müssen jedoch sorgfältige Kontrollen in Betracht gezogen werden, um die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen nicht zu beeinträchtigen. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse dynamischer Caspase-Interaktionen auf Inflammasomenebene sowie für die Abfrage der entzündlichen Signalkaskaden in lebenden MDM und Monozyten, die aus menschlichen Blutproben stammen.
Introduction
Die Caspasen sind eine Familie von Cystein-Aspartat-Proteasen, die in Initiator-Caspasen und Scharfrichter-Caspases gruppiert werden können. Scharfrichter-Caspasen umfassen Caspase-3, -6 und -7. Sie kommen natürlicherweise in Zellen als Dimere vor und werden von den Initiator-Caspasen gespalten, um Apoptose1 auszuführen. Initiator-Caspasen umfassen menschliche Caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 und -12. Sie werden als inaktive Zymogene (Pro-Caspasen) gefunden, die durch näherungsinduzierte Dimerisierung aktiviert und durch autoproteolytische Spaltung stabilisiert werden 2,3. Die entzündlichen Caspasen sind eine Teilmenge der Initiator-Caspasen2 und umfassen Caspase-1, -4, -5 und -12 beim Menschen sowie Caspase-1, -11 und -12 bei Maus 4,5. Sie spielen keine apoptotische Rolle, sondern eine zentrale Rolle bei Entzündungen. Sie vermitteln die proteolytische Verarbeitung und Sekretion von Pro-Interleukin (IL)-1β und Pro-IL-186,7, den ersten Zytokinen, die als Reaktion aufpathogene Eindringlinge 8,9 freigesetzt werden. Caspase-1 wird bei der Rekrutierung für seine Aktivierungsplattform aktiviert; ein Proteinkomplex mit hohem Molekulargewicht, der als Inflammasom bezeichnet wird (Abbildung 1A)10. Die Dimerisierung von Caspase-4, -5 und -11 erfolgt unabhängig von diesen Plattformen durch einen nicht-kanonischen Inflammasom-Weg11,12.
Kanonische Inflammasomen sind zytosolische multimere Proteinkomplexe, die aus einem Inflammasom-Sensorprotein, dem Adapterprotein ASC (Apoptose-assoziiertes Speck-ähnliches Protein, das eine CARD enthält) und dem Effektorprotein Caspase-110 bestehen. Die am besten untersuchten kanonischen Inflammasomen sind die NOD-ähnliche Rezeptorfamilie, die eine Pyrindomäne (NLRP), NLRP1 und NLRP3 enthält, die NLR-Familie, die eine CARD (NLRC), NLRC4 enthält, und die fehlenden in Melanom 2 (AIM2). Sie enthalten jeweils eine Pyrindomäne, eine CARD oder beide Domänen. Die CARD-Domäne vermittelt die Interaktion zwischen CARD-haltigen Caspasen und ihren Upstream-Aktivatoren. Daher wird das Gerüstmolekül ASC, das aus einer N-terminalen Pyrindomäne (PYD) und einem C-terminalen CARD-Motiv 13,14 besteht, für die Rekrutierung von Caspase-1 zu den NLRP1 10-, NLRP3 15- und AIM2 16-Inflammasomen benötigt.
Jedes Inflammasom ist nach seinem einzigartigen Sensorprotein benannt, das unterschiedliche entzündungsfördernde Reize erkennt (Abbildung 1B). Aktivatoren dieses Pfades werden als kanonische Reize bezeichnet. Inflammasomen dienen als Sensoren für mikrobielle Komponenten und Gewebestress und lösen durch Aktivierung der Entzündungskaspasen eine robuste Entzündungsreaktion aus17. Die Inflammasom-Assemblierung initiiert die Caspase-1-Aktivierung, um die Reifung und Sekretion ihrer Hauptsubstrate pro-IL-1β und pro-IL-18 zu vermitteln. Dieser Prozess erfolgt über einen zweistufigen Mechanismus. Erstens reguliert ein Priming-Stimulus die Expression bestimmter Inflammasom-Proteine und Pro-IL-1β durch Aktivierung des NF-κB-Signalwegs. Zweitens induziert ein intrazellulärer (kanonischer) Reiz die Inflammasom-Assemblierung und Rekrutierung von Prochasase-1 6,7.
Caspase-4 und Caspase-5 sind die menschlichen Orthologe der murinen Caspase-1111. Sie werden inflammasomenunabhängig durch intrazelluläres Lipopolysaccharid (LPS), ein Molekül, das in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien18,19,20 vorkommt, und durch extrazelluläres Häm, ein Produkt der Hämolyse roter Blutkörperchen 21, aktiviert. Es wurde vorgeschlagen, dass LPS direkt an das CARD-Motiv dieser Proteine bindet und ihre Oligomerisierung induziert20. Die Aktivierung von Caspase-4 oder Caspase-5 fördert die IL-1β-Freisetzung, indem sie eine entzündliche Form des Zelltods namens Pyroptose durch Spaltung des porenbildenden Proteins Gasdermin D (GSDMD) 18,19 induziert. Darüber hinaus induziert der Ausfluss von Kaliumionen, die aus Caspase-4 und GSDMD-vermitteltem pyroptotischem Tod resultieren, die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms und die anschließende Aktivierung von Caspase-122,23. Daher gelten Caspase-4, -5 und -11 als intrazelluläre Sensoren für LPS, die in der Lage sind, Pyroptose und Caspase-1-Aktivierung als Reaktion auf spezifische Reize11,24 zu induzieren.
Abbildung 1: Entzündliche Caspasen und Caspase-bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC) Assay. (A) Diagramm des Caspase-BiFC-Systems, bei dem zwei Caspase-1-Prodomänen (C1-pro), die mit jedem nicht-fluoreszierenden Fragment der Venus (Venus-C oder Venus-N) verbunden sind, für die NLRP3-Aktivierungsplattform rekrutiert werden, wodurch die Venus gezwungen wird, sich zu verformen und zu fluoreszieren. Dieser Komplex erscheint als grüner Fleck unter dem Mikroskop und dient als Auslese für entzündliche Caspase-induzierte Nähe, die der erste Schritt bei der Aktivierung der Initiator-Caspase ist. (B) Schematische Darstellung der Domänenorganisation von Inflammasom-Komponenten und entzündlichen Caspasen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Messung der Aktivierung spezifischer Initiatorkaspasen ist schwierig, und es gibt nicht viele Methoden, um dies durch bildgebende Ansätze zu tun. Die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) von Caspase kann verwendet werden, um die entzündliche Caspase-Aktivierung direkt in lebenden Zellen sichtbar zu machen (Abbildung 1A)25. Diese Technik wurde kürzlich für den Einsatz in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) angepasst21. Caspase BiFC misst den ersten Schritt in der entzündlichen Caspase-Aktivierung, induzierte Nähe, um die Dimerisierung zu erleichtern. Es wird die Expression von Plasmiden verwendet, die für die CARD-haltige Caspase-Prodomain kodieren, die mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des photostablen gelben fluoreszierenden Proteins Venus (Venus-C [VC]) und Venus-N [VN] verschmolzen sind. Wenn die beiden Caspase-Prodomänen für ihre Aktivierungsplattform rekrutiert werden oder induzierte Nähe erfahren, werden die beiden Venushälften in die Nähe gebracht und gezwungen, sich umzuformen und zu fluoreszieren (siehe Abbildung 1A,B). Dies bietet eine Echtzeit-Anzeige der spezifischen entzündlichen Caspase-Aktivierung.
Humanes MDM exprimiert reichlich Inflammasom-Gene und Mustererkennungsrezeptoren, die Gefahrensignale und pathogene Produkte identifizieren. Dies bietet einen idealen Zelltyp für die Abfrage von entzündlichen Caspasebahnen. Darüber hinaus können sie aus peripherem Blut und sogar aus Patientenproben gewonnen werden, um die entzündliche Caspase-Aktivierung in einem bestimmten Krankheitszustand zu beurteilen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die BiFC-Caspase-Reporter mit Nukleofektion, einer auf Elektroporation basierenden Transfektionsmethode, in MDM eingeführt werden, wie die Zellen behandelt werden, um eine entzündliche Caspase-Aktivierung zu induzieren, und wie die aktiven Caspase-Komplexe mit mikroskopischen Ansätzen sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus kann diese Methodik angepasst werden, um die molekulare Zusammensetzung dieser Komplexe, die subzelluläre Lokalisation, die Kinetik und die Größe dieser hochgeordneten Strukturenzu bestimmen 25,26,27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Makrophagen aus Monozyten, die aus menschlichen Blutproben isoliert wurden, und eine Methode, um die entzündlichen Caspase-BiFC-Reporter effizient in das menschliche MDM einzuführen, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen.
Dieses Protokoll nutzt die BiFC-Technik35, um die entzündlichen Caspasen an der Caspase-Rekrutierungsdomäne (CARD) mit nicht-fluoreszierenden Fragm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des LBH-Labors in Vergangenheit und Gegenwart, die zur Entwicklung dieser Technik beigetragen haben. Dieses Lab wird unterstützt von NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Abbildung 2 wurde mit der Biorender-Software gezeichnet.
Materials
| 48 well tissue culture2:34 plates | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 cm Tissue Culture Dishes | VWR | 25382-166 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS columns | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Rinsing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMacs running buffer | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
| Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit | Zeiss | Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
| AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope | Zeiss | Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
| DPBS without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | Available by request from LBH lab | ||
| LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS Columns | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| MACS 15 mL Tube Rack | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| mCherry plasmid | Yungpeng Wang Lab | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes |
| Nigericin sodium salt, ready made solution | Sigma | SML1779-1ML | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software | Zeiss | Any software used to operate the confocal microscope of choice |
References
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).
- Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
- Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
- Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
- Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
- Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
- van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
- Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
- Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
- Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
- Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
- Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
- Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
- Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
- Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
- Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
- Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
- Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
- Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
- Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
- Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
- Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
- Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What’s the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
- Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).
