Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro
Summary
Dieser Beitrag beschreibt eine explantationskulturbasierte Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer, patientenspezifischer humaner Aortenglattmuskelzellen und dermaler Fibroblasten. Weiterhin wird eine neuartige Methode zur Messung der Zellkontraktion und anschließenden Analyse vorgestellt, mit der patientenspezifische Unterschiede in diesen Zellen untersucht werden können.
Abstract
Glatte Muskelzellen (SMCs) sind der vorherrschende Zelltyp in den Aortenmedien. Ihre kontraktile Maschinerie ist wichtig für die Kraftübertragung in der Aorta und reguliert die Vasokonstriktion und Vasodilatation. Mutationen in Genen, die für die SMC-kontraktilen Apparatusproteine kodieren, sind mit Aortenerkrankungen wie thorakalen Aortenaneurysmen assoziiert. Die Messung der SMC-Kontraktion in vitro ist eine Herausforderung, insbesondere im Hochdurchsatz, was für das Screening von Patientenmaterial unerlässlich ist. Derzeit verfügbare Methoden sind für diesen Zweck nicht geeignet. Dieser Beitrag stellt eine neuartige Methode vor, die auf der Impedanzmessung von elektrischen Zellen und Substraten (ECIS) basiert. Zunächst wird ein Explantationsprotokoll beschrieben, um patientenspezifische humane primäre SMCs aus Aortenbiopsien und patientenspezifischen humanen primären dermalen Fibroblasten zur Untersuchung von Aortenaneurysmen zu isolieren. Als nächstes wird eine detaillierte Beschreibung einer neuen Kontraktionsmethode gegeben, um die kontraktile Reaktion dieser Zellen zu messen, einschließlich der anschließenden Analyse und des Vorschlags zum Vergleich verschiedener Gruppen. Mit dieser Methode kann die Kontraktion adhärenter Zellen im Rahmen von translationalen (kardiovaskulären) Studien sowie Patienten- und Medikamenten-Screening-Studien untersucht werden.
Introduction
Glatte Muskelzellen (SMCs) sind der vorherrschende Zelltyp in der Aortenmedialschicht, der dicksten Schicht der Aorta. Innerhalb der Wand sind sie radial orientiert und unter anderem an Vasokonstriktion und Vasodilatation beteiligt1. Die kontraktile SMC-Maschinerie ist an der Kraftübertragung in der Aorta durch die funktionelle Verbindung mit der extrazellulären Matrix2 beteiligt. Mutationen in Genen, die für die Proteine des SMC-kontraktilen Apparates kodieren, wie die schwere Kette der glatten Muskulatur Myosin (MYH11) und das glatte Muskelaktin (ACTA2), wurden mit Fällen von familiären thorakalen Aortenaneurysmen in Verbindung gebracht, was die Relevanz der SMC-Kontraktion für die Aufrechterhaltung der strukturellen und funktionellen Integrität der Aortaunterstreicht 1,2 . Darüber hinaus sind Mutationen im TGFβ-Signalweg auch mit Aortenaneurysmen assoziiert, und ihre Auswirkungen in der Pathophysiologie des Aortenaneurysmas können auch in Hautfibroblasten3 untersucht werden.
Die Hochdurchsatzmessung der SMC-Kontraktion in vitro ist eine Herausforderung. Da die SMC-Kontraktilität beim Menschen nicht in vivo gemessen werden kann, stellen In-vitro-Assays an menschlichen Zellen eine praktikable Alternative dar. Darüber hinaus wird die Entwicklung eines abdominalen Aortenaneurysmas (AAA) in Tiermodellen entweder chemisch induziert, beispielsweise durch Elastaseperfusion, oder durch eine spezifische Mutation verursacht. Daher sind Tierdaten nicht mit der AAA-Entwicklung beim Menschen vergleichbar, die meist eine multifaktorielle Ursache hat, wie Rauchen, Alter und/oder Atherosklerose. In vitro Die SMC-Kontraktilität wurde bisher hauptsächlich durch Zugkraftmikroskopie 4,5, Quantifizierung der intrazellulären Fura-2-Calciumflüsse6 und Kollagenfalten-Assays7 gemessen. Während die Zugkraftmikroskopie einen unschätzbaren numerischen Einblick in die von einer einzelnen Zelle erzeugten Kräfte bietet, ist sie aufgrund der komplexen mathematischen Datenverarbeitung und der Analyse einer Zelle nach der anderen nicht für ein Hochdurchsatz-Screening geeignet, was bedeutet, dass es sehr zeitaufwendig ist, eine repräsentative Anzahl von Zellen pro Spender zu messen. Fura-2-Farbstoff- und Kollagenfalten-Assays ermöglichen die oberflächliche Bestimmung der Kontraktion und liefern keine präzise numerische Ausgabe, wodurch sie weniger geeignet sind, patientenspezifische Unterschiede zu unterscheiden. Eine gestörte SMC-Kontraktion in Zellen, die aus der Aorta von Patienten mit Bauchaortenaneurysmen stammen, wurde erstmals durch die Optimierung einer neuartigen Methode zur Messung der SMC-Kontraktion in vitro8 nachgewiesen. Dies geschah durch die Wiederverwendung der ECIS-Methode (Electric Cell-Substrat Impedance Sensing). ECIS ist ein Echtzeit-Assay mit mittlerem Durchsatz zur Quantifizierung des adhärenten Zellverhaltens und der Kontraktion 9,10,11 wie SMC-Wachstum und -Verhalten in Wundheilungs- und Migrationsassays12,13,14. Die genaue Methode ist im Protokollabschnitt beschrieben. Auf diese optimierte Weise kann das ECIS aufgrund ihrer ähnlichen Größe und Morphologie auch zur Untersuchung der Fibroblastenkontraktion verwendet werden.
Ziel dieses Papiers ist es, eine schrittweise Beschreibung der Methode zur Messung der SMC-Kontraktion in vitro unter Verwendung von ECIS8 und zum Vergleich der Kontraktion zwischen Kontroll- und Patienten-SMCs zu liefern. Zunächst wird die Isolierung und Kultivierung von primären SMCs aus Kontroll- und Patientenaortenbiopsien erläutert, die zur Kontraktionsmessung genutzt werden können. Zweitens werden Kontraktionsmessungen und -analysen sowie die Überprüfung der SMC-Markerexpression beschrieben. Darüber hinaus beschreibt dieser Beitrag die Methode zur Isolierung patientenspezifischer dermaler Fibroblasten, deren Kontraktion mit der gleichen Methodik gemessen werden kann. Diese Zellen können für patientenspezifische Studien verwendet werden, die sich auf Aortenaneurysmen oder andere kardiovaskuläre Pathologien15 konzentrieren, oder für prognostische Studien unter Verwendung eines Transdifferenzierungsprotokolls, das eine Kontraktionsmessung vor einer Aneurysmaoperationermöglicht 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier stellt eine Methode zur Messung der SMC-Kontraktion in vitro vor, basierend auf den Änderungen der Impedanz und der Oberflächenbesetzung. Zunächst wird die Isolierung, Kultivierung und Expansion von patientenspezifischen primären menschlichen SMCs und Hautfibroblasten beschrieben, gefolgt von deren Verwendung für Kontraktionsmessungen.
Eine Einschränkung der Studie hängt mit der Gewinnung der Zellen durch ein Explantationsprotokoll zusammen. Die Zellen, die sich …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, dem PAREL-AAA-Team und allen Gefäßchirurgen der Amsterdamer UMC, des Zaans Medisch Centrums und des Dijklander-Krankenhauses für die Bereitstellung von Materialien und Unterstützung für diese Studie.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
References
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
