Summary

Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

Published: November 16, 2021
doi:

Summary

Dans cette étude, nous présentons un protocole efficace et reproductible pour isoler les populations immunitaires du système respiratoire murin. Nous fournissons également une méthode pour l’identification de toutes les cellules immunitaires innées et adaptatives qui résident dans les poumons de souris saines, en utilisant un panel de cytométrie en flux à base de 9 couleurs.

Abstract

Les voies respiratoires sont en contact direct avec l’environnement extérieur et nécessitent un système immunitaire régulé avec précision pour fournir une protection tout en supprimant les réactions indésirables aux antigènes environnementaux. Les poumons hébergent plusieurs populations de cellules immunitaires innées et adaptatives qui assurent la surveillance immunitaire mais interviennent également dans les réponses immunitaires protectrices. Ces cellules, qui maintiennent le système immunitaire pulmonaire sain en équilibre, participent également à plusieurs conditions pathologiques telles que l’asthme, les infections, les maladies auto-immunes et le cancer. L’expression sélective des protéines de surface et intracellulaires fournit des propriétés immunophénotypiques uniques aux cellules immunitaires du poumon. Par conséquent, la cytométrie en flux joue un rôle déterminant dans l’identification de ces populations cellulaires dans des conditions d’équilibre et pathologiques. Cet article présente un protocole qui décrit une méthode cohérente et reproductible pour identifier les cellules immunitaires qui résident dans les poumons de souris saines dans des conditions d’équilibre. Cependant, ce protocole peut également être utilisé pour identifier les changements dans ces populations cellulaires dans divers modèles de maladie afin d’aider à identifier les changements spécifiques à la maladie dans le paysage immunitaire pulmonaire.

Introduction

Les voies respiratoires murines contiennent un système immunitaire unique responsable de la lutte contre les agents pathogènes et du maintien de l’homéostasie immunitaire. Le système immunitaire pulmonaire se compose de populations cellulaires avec une hétérogénéité significative dans leur phénotype, leur fonction, leur origine et leur emplacement. Les macrophages alvéolaires résidents (AM), provenant principalement de monocytes fœtaux, résident dans la lumière alvéolaire1, tandis que les macrophages interstitiels dérivés de la moelle osseuse (IM) résident dans le parenchyme pulmonaire2. Les MESSAGES instantanés peuvent être subclassés par l’expression CD206. Les IM CD206+ peuplent la région péribronchique et périvasculaire, tandis que les IM CD206 sont situés à l’interstitium alvéolaire3. Quelques sous-classifications des GI ont été proposées récemment3,4,5,6. Bien que les MI soient moins étudiées que les AM, des preuves récentes soutiennent leur rôle crucial dans la régulation du système immunitaire du poumon7. En outre, CD206 est également exprimé dans AMs8 activé alternativement.

Les cellules dendritiques pulmonaires (DC) sont un autre groupe hétérogène de cellules immunitaires pulmonaires en ce qui concerne leurs propriétés fonctionnelles, leur emplacement et leur origine. Quatre sous-catégories de DC ont été décrites dans les poumons : les DC CD103+ conventionnels (également connus sous le nom de cDC1), les DC CD11b+ conventionnels (également connus sous le nom de cDC2), les DC dérivés de monocytes (MoDC) et les DC plasmocytoïdes9,10,11,12,13. Les trois premières sous-classes peuvent être définies comme complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) II+CD11c+9,10,14,15. Les DC plasmocytoïdes expriment le CMH II et sont moyennement positifs pour cd11c, mais expriment des niveaux élevés de B220 et de PDCA-19,13,16. Dans les poumons murins naïfs, les DC CD103 et CD11b sont situés dans l’interstitium des voies respiratoires, tandis que les DC plasmocytoïdes sont situés dans l’interstitium alvéolaire17.

Deux grandes populations de monocytes résident dans le poumon pendant l’état d’équilibre: les monocytes classiques et les monocytes non classiques. Les monocytes classiques sont Ly6C+ et sont essentiels pour la réponse inflammatoire initiale. En revanche, les monocytes non classiques sont Ly6C et ont été largement considérés comme des cellules anti-inflammatoires3,16,18. Récemment, une population supplémentaire de monocytes CD64+CD16.2+ a été décrite, qui proviennent de monocytes Ly6C et donnent naissance à CD206+ IMs3.

Les éosinophiles apparaissent principalement dans les poumons lors d’une infection à helminthes ou de conditions allergiques. Cependant, il y a un petit nombre d’éosinophiles dans le parenchyme pulmonaire pendant l’état d’équilibre, connus sous le nom d’éosinophiles résidents. Contrairement aux éosinophiles résidents, les éosinophiles inflammatoires se trouvent dans l’interstitium pulmonaire et le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans les modèles murins d’acariens de la poussière domestique (HDM), les éosinophiles inflammatoires sont recrutés dans les poumons après une stimulation médiée par l’antigène. Il a été proposé que les éosinophiles résidents pourraient avoir un rôle régulateur dans l’allergie en inhibant la sensibilisation de T helper 2 (Th2) à HDM19.

Contrairement au reste des cellules myéloïdes pulmonaires, les neutrophiles expriment Ly6G mais pas CD68 et sont caractérisés par une signature de l’immunophénotype CD68-Ly6G+16,20,21. Des études de visualisation ont montré qu’à l’état d’équilibre, le poumon réserve un pool de neutrophiles dans le compartiment intravasculaire et héberge un nombre considérable de neutrophiles extravasculaires22. Semblable aux éosinophiles, les neutrophiles ne se trouvent pas dans BAL à l’état d’équilibre; cependant, plusieurs formes de stimulation immunitaire, telles que le défi LPS, l’asthme ou la pneumonie, conduisent les neutrophiles dans la lumière alvéolaire, ce qui entraîne leur présence dans BAL21,22,23.

Un nombre important de cellules CD45+ du poumon représentent un tueur naturel (NK), des cellules T et des cellules B et sont négatives pour la plupart des marqueurs myéloïdes24. Dans les poumons de souris naïves, ces trois types de cellules peuvent être identifiés sur la base de l’expression de CD11b et de CMH II18. Environ 25% des cellules PULMONAIREs CD45+ sont des cellules B, tandis que le pourcentage de cellules NK est plus élevé dans les poumons que les autres tissus lymphoïdes et non lymphoïdes24,25,26. Parmi les lymphocytes T pulmonaires, une fraction considérable est CD4-CD8 et joue un rôle important dans les infections respiratoires26.

Parce que le poumon héberge un système immunitaire très complexe et unique, plusieurs stratégies de contrôle pour l’identification des cellules immunitaires pulmonaires ont été développées et rapportées16,18,20,27. La stratégie de contrôle décrite ici fournit un moyen complet et reproductible d’identifier jusqu’à 12 populations immunitaires myéloïdes et non myéloïdes pulmonaires différentes à l’aide de 9 marqueurs. Des marqueurs supplémentaires ont été utilisés pour valider les résultats. En outre, une méthode détaillée est fournie pour la préparation d’une suspension unicellulaire qui minimise la mort cellulaire et permet l’identification du profil le plus complet du compartiment cellulaire immunitaire du poumon. Il convient de noter que l’identification des cellules non immunitaires du poumon, telles que les cellules épithéliales (CD45-CD326+CD31), les cellules endothéliales (CD45-CD326-CD31+) et les fibroblastes nécessite une approche différente28,29. L’identification de ces populations n’est pas incluse dans le protocole et la méthode décrits ici.

Protocol

Toutes les études et expériences décrites dans ce protocole ont été menées selon les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Beth Israel Deaconess Medical Center. Des souris C57BL/6 âgées de six à dix semaines de l’un ou l’autre sexe ont été utilisées pour développer ce protocole. 1. Excision chirurgicale et préparation des tissus Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de 1 mL de tribromoéthanol (prép…

Representative Results

Stratégie de contrôleLa première étape de notre stratégie de contrôle est l’exclusion des débris et des doublets (Figure 1A). Une exclusion prudente des doublets est essentielle pour éviter les populations faussement positives (figure supplémentaire S2). Ensuite, les cellules immunitaires sont identifiées à l’aide de CD45+, un marqueur des cellules hématopoïétiques (Figure 1B). La tache morte viv…

Discussion

L’identification des cellules immunitaires pulmonaires peut être difficile en raison des multiples types de cellules immunitaires résidant dans le poumon et de leurs caractéristiques immunophénotypiques uniques par rapport à leurs homologues résidant dans d’autres tissus. Dans plusieurs conditions pathologiques, des cellules présentant des caractéristiques phénotypiques distinctes apparaissent dans les poumons. Par exemple, les lésions pulmonaires induites par la bléomycine entraînent le recrutement de ma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01CA238263 et R01CA229784 (VAB).

Materials

10 mL syringe plunger EXELINT 26265
18 G needles BD Precision Glide Needle 305165
21 G needles BD Precision Glide Needle 305195
50 mL conical tubes Falcon 3520
70 μm cell strainer ThermoFisher 22363548
96-well plates Falcon/corning 3799
ACK Lysing Buffer ThermoFisher A10492-01
anti-mouse CD11b Biolegend 101215 For details see Table 2
anti-mouse CD11c Biolegend 117339 / 117337 For details see Table 2
anti-mouse CD45 Biolegend 103115 For details see Table 2
anti-mouse CD64 Biolegend 139319 For details see Table 2
anti-mouse CD68 Biolegend 137009 For details see Table 2
anti-mouse GR-1 Biolegend 108433 For details see Table 2
anti-mouse Siglec F Biolegend 155503 For details see Table 2
AVERTIN Sigma-Aldrich 240486
B220 Biolegend 103228 For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8
CD103 Biolegend 121405 / 121419 For details see Table 2
CD24 Biolegend 138503 For details see Table 2
CD3 Biolegend 100205 For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1 Worthington Biochemical Corp LS004196
CX3CR1 Biolegend 149005 For details see Table 2
DNase I Millipore Sigma 10104159001
Ethanol
F4/80 Biolegend 123133 For details see Table 2
FcBlock (CD16/32) Biolegend 101301 For details see Table 2
Fetal Bovine Serum R&D Systems
Fine Serrated Forceps Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher 00-5523-00
Futura Safety Scalpel Merit Medical Systems SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit ThermoFisher L34973 For details see Table 2
MERTK Biolegend 151505 For details see Table 2
MHC-II Biolegend 107621 For details see Table 2
NK1.1 Biolegend 108705 For details see Table 2
Orbital Shaker VWR Model 200
Petri dish Falcon 351029
Refrigerated benchtop centrifuge SORVAL ST 16R
Small curved scissor Roboz Surgical Instrument Co

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Christofides, A., Cao, C., Pal, R., Aksoylar, H. I., Boussiotis, V. A. Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung. J. Vis. Exp. (177), e62985, doi:10.3791/62985 (2021).

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