Summary

Monitoramento em tempo real da respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas

Published: October 19, 2021
doi:

Summary

A adaptação metabólica é fundamental para as células T, pois dita diferenciação, persistência e citotoxicidade. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para monitorar a respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas ex vivo .

Abstract

Durante a ativação, o metabolismo das células T se adapta a mudanças que impactam seu destino. Um aumento da fosforilação oxidativa mitocondrial é indispensável para a ativação celular T, e a sobrevivência das células T da memória depende da remodelagem mitocondrial. Consequentemente, isso afeta o resultado clínico a longo prazo das imunoterapias contra o câncer. Mudanças na qualidade das células T são frequentemente estudadas pela citometria de fluxo usando marcadores superficiais bem conhecidos e não diretamente pelo seu estado metabólico. Este é um protocolo otimizado para medir a respiração mitocondrial em tempo real de células T humanas primárias usando um Analisador de Fluxo Extracelular e as citocinas IL-2 e IL-15, que afetam de forma diferente o metabolismo das células T. Mostra-se que o estado metabólico das células T pode ser claramente distinguido medindo o consumo de oxigênio ao inibir os principais complexos na via metabólica e que a precisão dessas medidas é altamente dependente da ótima concentração inibidora e estratégia de injeção inibidora. Este protocolo padronizado ajudará a implementar a respiração mitocondrial como um padrão para o condicionamento celular T no monitoramento e estudo de imunoterápicos cancerígenos.

Introduction

O desenvolvimento e a função correta das células T são essenciais para a capacidade do sistema imunológico de reconhecer e responder a antígenos. A fosforilação oxidativa mitocondrial (OxPhos) muda de acordo com o estado da célula T. As células T ingênuas usam predominantemente OxPhos para produzir ATP, enquanto as células T ativadas passam por uma transição metabólica onde a glicólise se torna dominante1. Após a fase do efeito, o pequeno subconjunto remanescente de células T de memória reverte para um estado metabólico dominado por OxPhos2,3. As mudanças de OxPhos seguem a diferenciação das células T a tal ponto que até mesmo subconjuntos de células T podem ser diferenciados por suas propriedades específicas é as propriedades OxPhos1. Por outro lado, o OxPhos é importante para a função das células T, e a inibição do OxPhos tem sido demonstrada para bloquear a proliferação e a citocina das células T4. Portanto, a capacidade de quantificar as propriedades do OxPhos da célula T de forma precisa e reprodutível é uma ferramenta poderosa para quem trabalha com células T.

Neste protocolo, as propriedades dos OxPhos da célula T são medidas usando um analisador de fluxo extracelular. A função central deste analisador é medir continuamente o teor de oxigênio das mídias de crescimento das células a serem analisadas. Acredita-se que o oxigênio removido da mídia de crescimento seja tomado pelas células. Ao tratar as células com uma variedade de inibidores ou modificadores oxphos, uma queda na captação de oxigênio está associada à função inibida ou modulada. Por exemplo, a inibição da synthase ATP levará a uma absorção celular reduzida de oxigênio que de outra forma seria usado para produzir ATP por fosforilação oxidativa. Outros equipamentos, incluindo o eletrodo Clark e o instrumento Oroboros, oferecem funcionalidade semelhante, e cada instrumento tem diferentes vantagens e deficiências. Uma ampla gama de tipos de células pode ser usada para estudos nesses dispositivos, mas um tipo particularmente desafiador de células é o linfócitos T primários humanos5. Devido ao seu pequeno tamanho, má sobrevivência ex vivo e propriedades não aderentes, as células T primárias humanas podem ser desafiadoras para estudar.

Este é um protocolo para estudar a respiração mitocondrial das células T primárias humanas por um analisador extracelular. O protocolo é dividido em uma corrida de otimização, onde são determinadas concentrações ideais de número celular por bem, bem como a concentração ideal de oligomicina e FCCP. Além disso, uma corrida de ensaio, onde as condições otimizadas são usadas.

Usando PBMCs humanos derivados do sangue e culturas primárias de células T ex vivo , este protocolo demonstra a importância da concentração inibidora ideal e a relevância do uso separado em vez de uma injeção sequencial de inibidores mitocondriais ao trabalhar com tipos celulares sensíveis. Finalmente, demonstra-se que este ensaio pode detectar robustamente diferenças sutis na respiração mitocondrial após a polarização com citocinas IL-2 e IL-15.

Protocol

Os experimentos foram realizados sob as diretrizes do Hospital Herlev e da Região da Capital da Dinamarca. NOTA: Este protocolo contém instruções tanto para uma execução de otimização quanto para uma execução de ensaios. Está claramente escrito no texto quando as instruções são para uma execução de otimização ou uma execução de ensaio. Execute uma corrida de otimização antes de continuar com as corridas de ensaio 1. Isolamento mononuclear…

Representative Results

Uma determinação correta das propriedades OxPhos é uma ferramenta indispensável ao estudar células T. No entanto, se as condições de ensaio não foram otimizadas, há um risco substancial de resultados enganosos ou errôneos. Neste protocolo, há um forte foco na otimização do número celular por poço e concentrações de oligomicina e FCCP a serem utilizadas. Na configuração descrita, a oligomicina e a FCCP são adicionadas incrementalmente ao mesmo poço, aumentando a concentração dos moduladores mitocond…

Discussion

Quantificação detalhada e correta da fosforilação oxidativa é uma ferramenta indispensável ao descrever os estados energéticos das células T. O estado de aptidão mitocondrial pode estar diretamente relacionado ao potencial de ativação de células T, sobrevivência e diferenciação1,5. Com este protocolo, é possível determinar as várias propriedades da fosforilação oxidativa (ver Tabela 4 para uma explicação detalhada). A quanti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kasper Mølgaard e Anne Rahbech receberam subsídios de Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard também recebeu uma bolsa de Børnecancerfonden.

Materials

24-well tissue culture plate Nunc 142485
Anti-CD3xCD28 beads Gibco 11161D
Antimycin A Merck A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell-Tak Corning 354240 For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D9170
Human Serum Sigma Aldrich H4522 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15 Peprotech 200-02
IL-2 Peprotech 200-15
Lymphoprep Stemcell Technologies 07801
Oligomycin Merck O4876
PBS Thermo Fisher 10010023
RPMI 1640 Gibco-Thermo Fisher 61870036
Seahorse Calibrant Agilent Technologies 102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 Agilent Technologies 103576-100 XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser Agilent Technologies Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates Agilent Technologies 102416-100 XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge Agilent Technologies 102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) Sigma Aldrich 36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) Sigma Aldrich S2770-100ML
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D
Seahorse wave Flux analyzer software

References

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Cite This Article
Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, Ö., Svane, I. M., thor Straten, P., Desler, C., Peeters, M. J. W. Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells. J. Vis. Exp. (176), e62984, doi:10.3791/62984 (2021).

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