Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para oclusão da veia retiniana usando rosa bengala e um sistema de microscópio de imagem retiniana guiado a laser com recomendações para maximizar sua reprodutibilidade em cepas geneticamente modificadas.
Modelos de camundongos de oclusão da veia retiniana (RVO) são frequentemente usados em oftalmologia para estudar a lesão hipóxico-isquêmica na retina neural. Neste relatório, um método detalhado que aponta etapas críticas é fornecido com recomendações para otimização para alcançar taxas de oclusão consistentemente bem-sucedidas em diferentes cepas de camundongos geneticamente modificados. O modelo de camundongo RVO consiste principalmente na administração intravenosa de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação a laser usando um microscópio de imagem da retina ligado a um laser guiado oftálmico. Três variáveis foram identificadas como determinantes da consistência da oclusão. Ajustando o tempo de espera após a administração de rosa bengala e equilibrando a linha de base e a saída experimental do laser, a variabilidade entre os experimentos pode ser limitada e uma maior taxa de sucesso das oclusões alcançada. Este método pode ser usado para estudar doenças da retina que são caracterizadas por edema de retina e lesão hipóxico-isquêmica. Além disso, como esse modelo induz lesão vascular, ele também pode ser aplicado para estudar a neurovasculatura, a morte neuronal e a inflamação.
A oclusão da veia retiniana (RVO) é uma doença vascular comum da retina que afetou aproximadamente 28 milhões de pessoas em todo o mundo em 20151. RVO leva ao declínio da visão e perda em adultos em idade ativa e idosos, representando uma doença que ameaça a visão em curso estima-se que aumente ao longo da década próxima. Algumas das patologias distintas do RVO incluem lesão hipóxico-isquêmica, edema de retina, inflamação e perda neuronal2. Atualmente, a primeira linha de tratamento para este distúrbio é através da administração de inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Embora o tratamento anti-VEGF tenha ajudado a melhorar o edema da retina, muitos pacientes ainda enfrentam declínio da visão3. Para entender melhor a fisiopatologia desta doença e testar possíveis novas linhas de tratamento, há a necessidade de constituir um protocolo de modelo de camundongo RVO funcional e detalhado para diferentes cepas de camundongos.
Modelos de camundongos foram desenvolvidos implementando o mesmo dispositivo a laser usado em pacientes humanos, emparelhado com um sistema de imagem dimensionado para o tamanho correto para um mouse. Este modelo de RVO em camundongo foi relatado pela primeira vez em 2007 4 e posteriormente estabelecido por Ebneter e outros 4,5. Eventualmente, o modelo foi otimizado por Fuma et al. para replicar as principais manifestações clínicas do RVO, como o edema de retina6. Desde que o modelo foi relatado pela primeira vez, muitos estudos o empregaram usando a administração de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação das principais veias da retina com um laser. No entanto, a quantidade e o tipo de corante que é administrado, a potência do laser e o tempo de exposição variam significativamente entre os estudos que usaram esse método. Essas diferenças muitas vezes podem levar ao aumento da variabilidade no modelo, dificultando a replicação. Até o momento, não há estudos publicados com detalhes específicos sobre possíveis caminhos para sua otimização.
Este relato apresenta uma metodologia detalhada do modelo de camundongo RVO na cepa C57BL/6J e uma cepa caspase-9 endotelial induzível por tamoxifeno (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J e de relevância para a patologia RVO como cepa de referência para um camundongo geneticamente modificado. Estudo prévio havia demonstrado que a ativação não apoptótica da caspase-9 endotelial instiga edema retiniano e promove morte neuronal8. A experiência usando essa cepa ajudou a determinar e fornecer informações sobre possíveis modificações para adaptar o modelo de camundongo RVO, que pode ser aplicável a outras cepas geneticamente modificadas.
O modelo RVO de camundongo fornece um caminho para entender melhor a patologia do RVO e testar possíveis terapêuticas. Embora o modelo RVO do mouse seja amplamente utilizado no campo, há a necessidade de um protocolo detalhado atual do modelo que aborde sua variabilidade e descreva a otimização do modelo. Aqui, fornecemos um guia com exemplos da experiência sobre o que pode ser alterado para obter os resultados mais consistentes em uma coorte de animais experimentais e fornecer dados confiáveis.
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
Refresh | Allergan | 94170 | |
Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |