يتم توفير بروتوكول عالي الإنتاجية للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) ، وتحسين خطوات التعامل مع السائل باستخدام جهاز شفط بسيط تم بناؤه بمضخة فراغ. يمكن تعقيم مئات عينات البذور في يوم واحد.
أربيدوبسيس هو إلى حد بعيد الأنواع نموذج النبات الأكثر استخداما على نطاق واسع للدراسات الوظيفية. التعقيم السطحي لبذور أربيدوبسيس هو خطوة أساسية مطلوبة لتحقيق هذه الغاية. وبالتالي، من الأهمية بمكان إنشاء طرق عالية الإنتاجية لتعقيم سطح بذور أربيدوبسيس للتعامل مع عشرات إلى مئات العينات (على سبيل المثال، الخطوط المعدلة وراثيا، أو الأنماط الإيكولوجية، أو المسوخ) في وقت واحد. يتم تقديم طريقة التعقيم السطحي للبذور على أساس القضاء الفعال على السائل في الأنابيب مع جهاز شفط محلي الصنع تم بناؤه من مضخة فراغ مشتركة في هذه الدراسة. من خلال الحد بشكل كبير من العمل الكثيف التدريب العملي على الوقت مع هذه الطريقة التعامل مع عدة مئات من العينات في يوم واحد ممكن مع القليل من الجهد. كما أشارت تحليلات الدورة الزمنية السلسلية إلى نطاق زمني مرن للغاية للتعقيم السطحي من خلال الحفاظ على معدلات إنبات عالية. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للتعقيم السطحي لأنواع أخرى من البذور الصغيرة مع تخصيص بسيط لجهاز الشفط وفقا لحجم البذور ، والسرعة المطلوبة للقضاء على السائل.
أربيدوبسيس هو نوع نباتي ثنائي الفصي ينتمي إلى عائلة براسيكاي. دورة حياتها قصيرة نسبيا (شهرين لكل جيل في ظل ظروف النمو ليوم طويل)، وحجم النبات الصغير، والتلقيح الذاتي مع إنتاج مئات البذور لكل نبات جعلت من أول نوع نموذج نباتي أساسي1،2. وبالإضافة إلى ذلك، كان تسلسل الجينوم لها تماما3،واسعة أدوات علم الوراثة العكسي (المشبعة T-DNA، transposon، والسكان المعدلة كيميائيا) متوفرة4،5،6، وفعالة Agrobacterium-بوساطة التحول راسخة للحصول على خطوط معدلة وراثيا كافية لمزيد من العمل المصب7 . وهكذا، خلال العقدين الماضيين، تم تحقيق تقدم كبير باستخدام Arabidopsis كنوع نموذجي لتشريح جوانب متنوعة من بيولوجيا النبات على المستوى الجزيئي، بما في ذلك الاختلاف الطبيعي والوراثي والفينوتيبيك8،9.
لتوصيف وظيفيا الجينات ذات الاهتمام في Arabidopsis، التعقيم السطحي البذور للقضاء على الملوثات الفطرية والبكتيرية هو الخطوة الأساسية لكثير من بروتوكولات المصب التي تتطلب الثقافات المحورية. التحول الوراثي لفرط التعبير10، الضربة القاضية (RNA-I11)أو خروج المغلوب (تحرير الجينوم12،13)من وظيفة الجينات ، توطين subcellular14، نشاط المروج15،16، البروتين البروتين17 والتفاعل بين البروتين والحمض النووي18، على سبيل المثال لا يذكر سوى التطبيقات الأكثر شيوعا ، وكلها تتطلب خطوة التعقيم سطح البذور. وهكذا، على الرغم من بساطته النسبية، يلعب تعقيم سطح البذور دورا أساسيا في العديد من التحليلات الوظيفية.
حتى الآن، وقد وضعت فئتين رئيسيتين من أساليب التعقيم السطحي البذور على أساس إما الغاز أو على التعقيم في مرحلة السائل19. وفي حين أن إنتاجية التعقيم السطحي للبذور في مرحلة الغاز متوسطة إلى عالية، فإن استخدام غاز الكلور الكاشف الخطر كعامل تعقيم سطحي أعاق تطبيقه على نطاق واسع. تعتمد الطرق القائمة على التعقيم في المرحلة السائلة ، على العكس من ذلك ، على مواد كيميائية أكثر اعتدالا مثل الإيثانول وحلول التبييض للتعقيم السطحي ، وتستخدم على نطاق أوسع على الرغم من أن إنتاجها أقل بطبيعته من تبخير الكلور. بشكل عام، يتم استخدام طريقتين مختلفتين تستخدمان الكواشف السائلة بشكل عام. ويستند أسلوب واحد يستخدم إلى حد كبير على الغسيل مع الإيثانول والتبييض بتركيزات مختلفة لمدة مختلفة من الوقت20،21. ويستند أسلوب آخر على تطبيق التبييض فقط21،22. وتطبق كلتا الطريقتين أساسا لتعقيم سطح البذور على نطاق صغير. ومع ذلك، في العديد من التجارب، فمن الضروري لفحص العديد من خطوط أربيدوبسي المعدلة وراثيا المستمدة من تحويل واحد15،23 أو الشاشة في موازاة العديد من خطوط المعدلة وراثيا ولدت من التحولات المختلفة24،25. وعلى حد علمنا، لم تنشر أي طريقة قائمة على السوائل لتعقيم سطح البذور عالي الإنتاجية، مما يشكل، على الرغم من عدم الاعتراف به، اختناقا هاما لنهج الجينوم الوظيفي. لذلك، تطوير أساليب آمنة وقوية وعالية الإنتاجية لتعقيم سطح البذور هو خطوة ضرورية وحاسمة نحو نجاح التوصيف الوظيفي للعديد من الجينات في وقت واحد.
وتحقيقا لهذه الغاية، في الدراسة الحالية، يتم تقديم طريقة محسنة للتعقيم السطحي لبذور الأرابيدوسيس. هذه الطريقة آمنة ومنخفضة التكلفة وقوية للغاية وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بالتعامل مع 96 خطا مستقلا في غضون ساعة واحدة من بداية تعقيم سطح البذور حتى نهاية بذر البذور في أطباق بيتري. تعتمد الطريقة التي أثبتت على الأجهزة المختبرية الأساسية المتاحة على نطاق واسع مثل مضخة فراغ ، وأواني زجاجية قابلة للاستهلاك ، وأدوات بلاستيكية. توفر هذه الطريقة المحسنة للمجتمع العلمي نهجا آمنا وبسيطا وبأسعار معقولة لتبسيط تعقيم سطح البذور مع إنتاجية كافية لنهج الجينوم الوظيفي الحديث في Arabidopsis وغيرها من الأنواع النباتية غير النموذجية.
تعقيم البذور هو الخطوة الأساسية للدراسات الوظيفية في Arabidopsis. على الرغم من أنه كثيرا ما يتم تنفيذها لأغراض مختلفة كثيرة، تتوفر دراسات محدودة على التعقيم السطحي للبذور عالية الإنتاجية في Arabidopsis.
حتى الآن، واحدة من الطرق ذات الإنتاجية العالية هي استخدام غاز الكلور الناتج عن خ?…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا البحث من قبل مقاطعة ترينتو المستقلة من خلال التمويل الأساسي لمجموعة الاقتصاد البيئي التابعة لمنظمة فوندازيون ماخ.
Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |