관련 인간 질병을 충실하게 재구성하는 포괄적인 체외 모델은 부족합니다. 현재 연구는 인간 간세포 암에서 종양 기질 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수있는 체외 도구인 3차원 (3D) 종양 스페로이드 생성 및 문화를 제시합니다.
간암의 주된 형태인 고급 간세포 암(HCC)을 위한 잘 용인되고 널리 효과적인 치료법의 공격성과 부족은 암 관련 사망의 두 번째로 흔한 원인으로 그 순위를 합리화합니다. 전임상 모델은 임상 개발을 위한 최고의 치료 후보를 선택하고 개인화된 약의 전달을 돕기 위하여 인간 조건을 재구성하기 위하여 적응될 필요가 있습니다. 3차원(3D) 셀룰러 스페로이드 모델은 2차원(2D) 단층 배양에 대한 새로운 체외 대안으로서 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 개별 세포가 매달려 있는 물방울에서 유지될 때 집계하는 능력을 이용하고, 표준 단층층 보다는 생체 내 환경을 더 대표하는 3D 종양 스페로이드 모형을 기술합니다. 더욱이, 3D 스페로이드는 균질성 또는 이질성 세포를 결합하여 생성될 수 있고, 생체 내세포 이질성을 더 반사하여 잠재적으로 진행 및 치료 반응에 영향을 미칠 수 있는 환경 상호 작용의 연구를 가능하게 한다. 현재 연구는 표준 10cm3 페트리 접시의 뚜껑에 세포 현탁액을 고정하여 3D 동종 및 이성종양 스페로이드를 형성하기 위해 세포 밀도를 최적화했다. 종방향 분석은 이종성 종양/섬유아세포 스페로이드 대 동종경에 대한 성장 곡선을 생성하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 동종종양(Hep3B) 스페로이드에 대한 섬유아세포(COS7 세포) 및 간 심섬유세포(LX2)의 증식적 충격이 조사되었다. 3,000개의 세포(20μL 배지)의 파종 밀도는 성공적으로 Huh7/COS7 이종성 구형 구형을 산출하여 8일째까지 의 크기가 꾸준히 증가하고 성장 지체가 뒤따랐습니다. 이 발견은 LX2 (인간 간 질질 세포주) 조건된 매체 (CM)에서 배양된 Hep3B 균질 구체를 사용하여 확증되었다. LX2 CM은 대조종양 스페로이드에 비해 Hep3B 스페로이드의 증식을 촉발시켰다. 결론적으로, 이 프로토콜은 3D 종양 스페로이드가 종양-기질 상호 작용을 보다 포괄적으로 연구하기 위해 간단한, 경제적, 및 시험 관 내 도구로 사용될 수 있음을 보여주었습니다.
간암에서 세계적인 부각 그리고 사망은 간 질병 및 암의 대부분의 그밖 모형에 대한 처리에 있는 어드밴스에 있는 어드밴스에 도 불구하고, 증가하는 것을 계속했습니다. 2018년, 간암은 대장암과 위암을 능가하여 전 세계적으로 암 관련 사망의 두 번째로 흔한 원인이 되었습니다1. 2020년에는 9,00,000건 이상의 새로운 진단이 있었으며, 전 세계 전체 암 사례의 4.7%를 차지했습니다1. 이것은 특히 실망스럽습니다, HCC의 발달을 위한 중요한 위험 요소가, 간암의 일반적인 양식, 잘 특징이다주어진 2. 간경변은 HCC 의 발달을 위한 일반적인 위험 요소입니다, 와 함께 80% 케이스의 확립된 간경변2의 배경에 개발. 간경변으로 진행되는 만성 간질환은 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 알코올 관련 간 질환(ARLD), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) -비만 및 제2형 당뇨병(T2DM)2,3에 기인한다. HCC를 위한 현재 관리 프로토콜은 단계 의존적이고 가장 빈약한 결과가 있는 향상된 암을 가진 사람들을 위해 제한됩니다4. 키나아제 억제제를 사용하여 상당한 어드밴스가 있었고, 최근에는 면역 종양학 치료법이 현실적으로 진행성 간암 환자 중 소수에만 혜택을 주어 있습니다5. 더욱이, NAFLD 환자에서 발생하는 HCC가 가장 빠르게 성장하는 근본 원인인 서방 국가에서 새로 진단된 HCC 사례의 50% 이상을 차지하는 것으로, 프로그램된 사망 1(PD1) 체크포인트 억제제 치료에 더 저항할 수 있다는 우려가 있다.
임상 시험및 그들의 끝점에 있는 중요한 개선을 포함하여 HCC를 가진 환자를 위한 임상 시험에 있는 대규모 투자가 있었습니다7. 실패의 10 년 후에, 이 투자는 환자를 위한 기회를 바꾸기 시작했습니다. 그러나, 현실은 응답자의 전반적인 비율이 상대적으로 가난한 남아 있다는 것입니다, 환자가 임상 시험에 모집하는 것은 수시로 진료소에서 돌보는 사람들을 대표하는 수시로 가난하게. 위험은 진보가 비용이 많이 들고 많은 사람들이 아닌 소수의 사람들에게 이익이 된다는 것입니다. 단일 사용 또는 조합에 대한 더 많은 후보 치료가 등장함에 따라 전임상 모델이 생체 내 반응을 더 예측하는 것이 필수적입니다. 이들은 인간 HCC 이질성 및 병리학적 복잡성을 더 잘 반영하는 환자 반응에서 보인 가변성에 기여하는 추가 요인을 통합하는 모형일 확률이 높습니다8. HCC의 생체 내 병리학 적 조건을 재현하는 시스템은 종양 진화, 성장 및 진행의 생물학을 이해하는 데 도움이됩니다. 만성 간 질환과 HCC의 기존 실험 모델은 일반적으로 생체 내 동물 기반 모델(검토 된 in9), 체외 배양 10 및 ex vivo11,12 모델의 세 가지 주요 범주에 속합니다. 동물 기반 접근은 HCC를 포함하여 만성 간 질병을 공부하기 위하여 광범위하게 이용됩니다; 그러나, 유전적 가변성, 높은 운영 비용 및 종 간의 다른 면역 계통은 그러한 모델을 적용하기 위한 주요 한계 중 하나입니다9. 일부 ex vivo 모델은 다른 체외 세포주 모델에 비해 인간 조직에 초점을 맞추기위한 훌륭한 도구를 제공하지만, 조직 가용성 및 제한된 실험 시간 과정은 대규모로 활용을 방해합니다.
다른 한편으로는, 체외 세포주 모형은 새로운 인간 조직의 일정한 공급을 가질 필요가 적은으로, 제한된 자원으로 일하는 과학자를 위한 좋은 선택권 남아 있습니다10. 이러한 모델은 또한 생체 내 모델에서 더 복잡한 진행하기 전에 약물 선택의 표적 검증을 돕기 위해 첫 번째 화면으로 사용할 수있는 도구를 제공합니다. 최근 기존의 2D 단층 배양을 3D 배양으로 개조하여 이들 체외 모델의 효능을 향상시켰습니다13,14.
체외 모델내 3D는 인간의 정상 및 병리학 적 조건에서 볼 수있는 중요한 기능을 재구성 할 수 있습니다. 생리학적 조건하에서, 신호 전달은 세포 간 상호 작용 및 다른 결합 조직 분자, 즉 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질과의 상호 작용을 통해 시작되어 3D 상호 작용 네트워크를 형성합니다15,16. 종양은 악성 변환 도중 3D 구형 형태로 발전하며, 산소와 영양소는 비종양/종양 상호 단계에서 쉽게 풍부합니다. 동시에, 저산소 조건은 종양 코어에 우세합니다. 영양 가용성에 있는 이질성은 종양 발생을 통제하는 공간적으로 구별되는 신호 및 신진 대사 통로의 활성화귀착됩니다. 이러한 조건은 기존의 2D 단층 배양14에서 제대로 재구성되지 못하며, 이 배양소는 생리학적으로 무관한 방식으로 딱딱한 배양 플라스틱으로 자랍니다. 암세포는 또한 다른 비-빈약한 세포, ECM의 1차 공급원, 성장 및 종양 미세 환경 내의 침략 신호와 통신한다. 2D 배양과 달리, 체외 모델의 3D는 이 종양-기질 상호작용을 연구하기에 더 적합한 플랫폼을 제공할 수 있다17.
3D 모델은 HCC 분야에서 널리 사용되고 있으며, 마이크로 조직이 형성되는 방식이 다양18,19,20,21,22,23이다. 이러한 모델의 대부분은 스페로이드 형성 과정에서 초저결합 판18,19,20,21,22 또는 트랜스 웰23을 사용했다. 설명된 프로토콜은 체외 3D 종양 스페로이드 모델에서 플라스틱이 없고 비용 효율적인 대체물방울 기술을 소개합니다. 이것은 3D 형식으로 종양 세포의 증식에 섬유 아세포의 paracrine 및 autocrine 역할을 평가하는 것을 용이하게 할 수 있습니다.
실험적인 세포주가 증가하는 맥락은 그들의 유전자 발현 단면도, 통로 분석 및 기능기준에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 유방암 세포에서, 다른 종양 유발 경로 사이의 협착은 암세포가 3D conformation27에서 성장하는 경우에만 유지된다. 3D 흑색종 및 유방암 스페로이드에서 조절유전자는 단층 세포에서는 아니지만, 생체 내 인간 종양28,29와 더 관련이 있다. 예를 들어, 유방 상피 세포 및 종양 대응에서 β1 내테그린 수준은 2D format29에서 자라난 수준보다 낮았다. 더욱이, 3D 구조물에 있는 섬유아세포는 plastic30에 배양된 것과 비교된 형태학 및 속도의 관점에서 명백하게 이동하는 경향이 있습니다. 또한, 성장 기판의 기계적 강성은 상피 세포에서 세포외 신호 조절 키나아제(ERK)/로의 조절을 완화하여 정상 상피 세포의 악성 변환을 장려하는 특정 경로를 활성화한다31. 이러한 요인은 3D 배양이 인간 질병에 더 많이 부합하기 때문에 기존의 2D 배양에서 3D 스페로이드 모델로의 전환을 선호합니다.
현재 연구는 3D 종양 스페로이드 모델을 생산하기 위해 기존의 실험실 도구와 공급을 사용했다. 형성 된 스페로이드는 섬유 아세포에서 나오는 확산 신호에 반응, 그들의 크게 증가 성장에 의해 표시. 이 모델은 다세포 종양 스페로이드 범주에 속한다. 3D 종양 스페로이드의 세 가지 다른 범주가 있다, 종양을 포함 하 여 32, 조직 유래 종양 spheres33,34, 그리고 organotypic 다세포 spheroids35. 다세포 종양 스페로이드에서 종양 세포는 배양 용기의 바닥을 만지지 않고 구체를 형성하기 위해 함께 집계할 수 있도록 낮은 접착 조건에서 일시 중단됩니다(36). 회전 시스템, 액체 오버레이 기술 및 코팅되지 않은 초저 부착 U 자형 플레이트37에 이르기까지 이 앵커리지 독립적 인 기술을 제공하기 위해 몇 가지 접근 법이 사용되었습니다. HCC에서, 대부분의 시험관 내 스페로이드 배양은 초저 부착 24- 또는 96웰 플레이트를 사용하여 둥근 스페로이드18,19,20,21,22를 형성한다. 그러나 이 기술은 비용 효율적이지 않으며 우발적인 세포 플라스틱 접촉을 배제하지 않습니다. 다른 시스템은 간 미세 조직을 생산하기 위해 트랜스 웰스23 또는 간 슬라이스12를 사용합니다. 번역 작업에 인간의 조직을 사용 하 여 금 표준 하지만 항상 사용할 수 또는 많은 연구 그룹에 의해 액세스할 수. 현재접근법은 매달려 있는 물방울 이론의 혜택을 받았다. 세포 현탁액은 종양 스페로이드가 접근 가능한 액체 공기 인터페이스에서 형성되도록 첨가되어 단일 둥근 구체38을 형성한다. 이 기술을 사용하는 장점은 세포 플라스틱 접촉의 부족과 종양과 섬유 아세포 세포 사이의 자동 크림과 파라크린 크로스토크를 연구하는 용이성입니다. 이 모델은 HCC 개발39로부터 간을 보호하는 비 구레나키말 TREM2의 중요성을 해독하는 또 다른 연구에서 더 검증되었다39. 이 작품은 Hep3B와 PLC/PRF5 스페로이드의 부피가 Wnt 의존식 방식으로 TREM2 과발형 LX2 CM에 비해 제어 LX2 CM에서 더 높았다는 것을 보여주었습니다39.
현재 연구에서, 섬유 아 세포는 이 공동 배양의 증식 충격을 조사하기 위하여 스페로이드 대형 의 앞에 종양 세포와 혼합되었습니다. 그 외는 종양으로 기질 세포 이주를 연구하기 위하여 종양 스페로이드를 형성한 후에 종양 세포 현탁액을 가진 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포를 추가했습니다40,41. 현재 이종경 스페로이드 모델은 이전에 보고된 모델과 생체 내 종양의 본래와 유사한 성장 패턴을 보였다. 스페로이드는 영양분고및 괴사 코어42의 확대로 인해 성장 단계가 지연된 후 기하급수적인 성장을 보여줍니다. 스페로이드 형성을 돕기 위해 성장 인자와 미토겐을 추가하는 대신, 이 연구는 섬유아세포와 직접 접촉하거나 섬유아세포 CM에 있는 그들의 분비에서 이 성장 요인을 함으로써 더 생리적인 접근을 이용했습니다. LX2 세포가 TGFβ1 또는 PDGF43로 치료함으로써 더 활성화될 수 있다는 점을 언급하는 것이 필수적입니다. LX2 세포는 상이한 실험 설정을 위한 매체를 제거하기 전에 48h에 대해 10 ng/mL TGFβ1로 처리되었다. LX2 세포는 PBS로 세 번 세척(어떤 직접 TGFβ1 효과를 배제하기 위해), 다음 CM을 수집하기 전에 또 다른 24h에 대한 신선한 미디어를 첨가하였다. TGFβ1-자극LX2로부터 수집된 CM은 제어 LX2로부터 CM보다 더 높은 속도로 Hep3B 스페로이드의 성장을 유도하였다(데이터는 도시되지 않음). 이 유연한 시스템은 다른 암 세포 플러스 /마이너스 섬유 아세포뿐만 아니라 환자 유래 라인의 공동 배양에 빌려 줄 수 있습니다. 또한 생체 내 연구에 대한 투약을 알리기 위해 번역 약물 발견 파이프라인에 신속하게 채택되고 삽입될 수 있는 약물에 대한 중간 처리량 검사 분석 방법을 제공할 수 있습니다.
현재 연구의 한계는 새로 분리 된 HCC 종양 세포 및 암 관련 섬유아세포보다는 스페로이드 형성에서 불멸의 세포주를 사용하는 것입니다. 또 다른 제한은 다른 비 섬유아세포 세포주에서 CM보다는 LX2에서 CM 사이 및 신선한 매체에서 종동 Hep3B 스페로이드의 성장을 비교하는 것입니다. 후자의 제한은 섬유아세포에 대한 관심 유전자의 유전자 변형에 의해 해결될 수 있으며, 이어서 야생형에서 유전자 조작된 섬유아세포에 동종포성 구형에 CM을 적용하여 해결할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
MYWZ는 영국의 공식 개발 지원 “ODA”와 뉴턴 기금의 일환으로 2020 년 비즈니스, 에너지 및 산업 전략 국무장관과 뉴턴 상에 의해 투자됩니다. SS는 암 연구 UK 고급 임상과학자 펠로우십 C53575/A29959에 의해 지원됩니다. SS, FO 및 HR은 헌터의 일환으로 자금을 지원, 암 연구 영국, 폰다지오네 AIRC, 펀다시온 Cientifica 드 라 아소시아시온 콘트라 엘 암 사이의 파트너십을 통해 자금.
1x Trypsin | Sigma Aldrich | 59429C | |
2 mL tubes | Eppendorf | ||
Biorender | Biorender.com | Online | |
Class II laminar flow BioMAT2 hood | Medair Technologies | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Biosera | M-D1107 | |
Excel sofware | Microsoft office 365 | ||
Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
Heat deactivated fetal bovine serum (FBS) | life tech | 105000064 | |
Image J software | Fiji | ||
L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513-100ml | |
Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
Petri dish 90 mm, triple vented | Greiner | 633175 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket | Rely+On™ | SCI-129999 | |
Ziess inverted microscope | Ziess |