Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal
Summary
Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.
Abstract
Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de vesículas extracelulares (EV) de las células. La absorción de EV juega un papel en la comunicación intercelular en varios campos de investigación; biología del cáncer, neurociencia y administración de fármacos. Muchos ensayos de captación de EV han sido reportados en la literatura; sin embargo, hay una falta de metodología experimental práctica y detallada. La absorción de EV se puede evaluar mediante el etiquetado fluorescente de EV para detectar su ubicación dentro de las células. Distinguir entre los EV internalizados en las células y los EV superficiales en las células es difícil, pero crítico, para determinar con precisión la absorción de EV. Por lo tanto, en este trabajo se propone un ensayo que cuantifica eficientemente la absorción de EV a través de la microscopía confocal de fluorescencia tridimensional (3D). Los EV marcados fluorescentemente se prepararon utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, visualizados por microscopía confocal 3D y luego analizados a través de un software avanzado de procesamiento de imágenes. El protocolo proporciona una metodología robusta para analizar los vehículos eléctricos a nivel celular y un enfoque práctico para un análisis eficiente.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EV) son partículas de tamaño nanométrico unidas a la membrana lipídica que se clasifican por sus tamaños: ectosomas (100-500 nm) y exosomas (50-150 nm)1. Los EV contienen varias biomoléculas, como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Estas biomoléculas se originan en las células antes de ser encapsuladas como carga y liberadas en el espacio extracelular a través de EV1,2,3.
Debido a la variedad de su carga, se cree que los vehículos eléctricos desempeñan un papel activo en la comunicación intercelular. La liberación y captación de EV por las células permite la transferencia de biomoléculas entre las células4,5. La introducción de carga EV en una celda puede alterar las funciones y el estado homeostático de la célula receptora4,5,6. Los evs se internalizan a través de múltiples vías; sin embargo, los mecanismos exactos no se han demostrado con precisión.
La mayoría de los ensayos de captación de EV, como el etiquetado genético, etiquetan fluorescentemente los EV individuales7. La señal resultante se puede medir mediante fotómetro de microplacas, citometría de flujo o microscopía, y cada tecnología tiene limitaciones sustanciales. Los fotómetros de microplacas, la citometría de flujo o la microscopía bidimensional estándar (2D) no pueden distinguir entre EV internalizados y conectados superficialmente8,9. Además, la preparación de muestras necesaria para cada una de estas técnicas puede introducir problemas adicionales a la evaluación de la absorción de EV. Por ejemplo, levantar células adheridas con tripsina antes del análisis de captación de EV puede escindir algunos EV adheridos superficialmente en la superficie de la célula10,11. La tripsina también puede interactuar con la superficie celular, afectando el fenotipo celular y EV. Además, la tripsina puede no separar por completo los EV superficiales, sesgando las poblaciones aisladas.
Para etiquetar con precisión los EV con tintes fluorescentes, se requieren pasos de lavado adicionales para eliminar el tinte residual7. Las técnicas de aislamiento aceptadas también pueden contribuir a las señales falsas positivas debido a la coagulación que ocurre durante el aislamiento de EV. Por ejemplo, la ultracentrifugación en serie (UC) se usa ampliamente para aislar los vehículos eléctricos y eliminar el tinte inmovilizado. Sin embargo, la CU puede co-precipitar los EV, y el tinte residual puede conducir a una señal falsa positiva12,13. Otros métodos de nanofiltración, como la filtración basada en columnas, también se utilizan ampliamente para la eliminación de colorantes no inmovilizados. La naturaleza compleja de los EV y el tinte que interactúan dentro de la matriz de la columna puede conducir a la eliminación incompleta del tinte residual debido a que el corte molecular de la columna se altera por la entrada compleja14,15,16.
El protocolo actual propone un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración para aislar y lavar vehículos eléctricos aislados marcados con fluorescencia. El dispositivo microfluídico basado en nanofiltración puede proporcionar una filtración eficiente a través de la tecnología de separación asistida por fluidos (FAST)17,18. FAST reduce la caída de presión a través del filtro, reduciendo así la agregación potencial entre los vehículos eléctricos y los tintes. Al eliminar eficientemente el colorante residual, es posible mejorar la calidad de los EV marcados fluorescentemente y la especificidad del ensayo.
La microscopía confocal puede distinguir entre EV internalizados y unidos superficialmente en la superficie celular e investigar exhaustivamente los mecanismos celulares de la absorción de EV en una resolución espaciotemporal19,20,21,22,23,24,25. Por ejemplo, Sung et al. describieron la visualización del ciclo de vida del exosoma utilizando su reportero de células vivas desarrollado. La localización de los EVs internalizados fue detectada y analizada mediante un microscopio confocal en herramientas tridimensionales (3D) y de procesamiento post-imagen20. Aunque el tamaño de los EV pequeños (40-200 nm) está por debajo del límite de resolución del microscopio óptico, los EV marcados fluorescentemente se pueden detectar mediante microscopía confocal, ya que el fotodetector puede detectar la emisión de fluorescencia mejorada. Por lo tanto, la localización subcelular de los EV marcados fluorescentemente dentro de una célula se puede determinar con precisión mediante la adquisición de múltiples imágenes apiladas en z de los EV y los orgánulos celulares circundantes.
Además, la reconstrucción 3D y el procesamiento posterior a los datos pueden proporcionar más información sobre el posicionamiento de los vehículos eléctricos internalizados, superficiales y flotantes. Al utilizar estos procesos junto con las imágenes de células vivas de lapso de tiempo ofrecidas por la microscopía confocal, el nivel de absorción de EV se puede evaluar con precisión, y también es posible el seguimiento en tiempo real de la captación de EV. Además, el análisis del tráfico de EV se puede realizar utilizando microscopía confocal mediante la evaluación de la colocalización de evs con orgánulos, un primer paso para determinar cómo los EV internalizados están involucrados en la función intracelular. Este protocolo describe la metodología para realizar un ensayo de captación de EV utilizando el dispositivo microfluídico basado en nanofiltración17,26, microscopía confocal y análisis post-imagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un ensayo de captación de EV basado en imágenes de fluorescencia 3D a través de microscopía confocal proporciona una metodología eficiente y un análisis sensible. Este etiquetado fluorescente EV facilita la visualización de evs y realiza con éxito un ensayo preciso de captación de EV. Se han notificado métodos anteriores para etiquetar los EV y eliminar el colorante residual mediante la eliminación de la precipitación mediante ultracentrifugación (CU); sin embargo, la CU puede co-precipitar los EV, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los números de subvención del NCI. U54CA143803, CA163124, CA093900 y CA143055 a K. J. P. Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de I + D de Tecnología de la Salud de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de subvención: HI19C1122). Obra de J. Kim y Y.-K. Cho fue apoyado por el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R020-D1), financiado por el Gobierno de Corea. Los autores agradecen a los miembros actuales y pasados del Instituto Urológico Brady, especialmente a los miembros del laboratorio Pienta-Amend, por la lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-‘T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -. K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -. H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
