该方案已被建立用于培养四氢生物蝶呤(BH4)-和诱导的一氧化氮合酶(iNOS)缺陷原代鼠巨噬细胞,以研究NO-氧化还原生物学。该研究的重点是减少传统分离和培养方法中发现的BH4和其他伪影的潜在污染,这些伪影可能会混淆实验结果和对结果的解释。
巨噬细胞来源于全身的造血祖细胞,是炎症过程的核心,并参与先天性和适应性免疫反应。巨噬细胞的 体外 研究可以通过从腹膜 离体 培养或通过骨髓祖细胞的分化形成骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)进行。巨噬细胞与前体分化的常见方法涉及使用来自L929细胞(LCM)的条件培养基。这种培养基易于自我生产,但存在批次变异性,其成分未定义。同样,胎儿牛血清(FBS)用于支持生长,但含有大量未定义分子的混合物,这些分子可能因批次而异。这些方法不足以研究一氧化氮生物学和氧化还原机制,因为它们都含有大量的小分子,这些小分子要么干扰氧化还原机制,要么补充辅因子水平,例如从诱导的一氧化氮合酶(iNOS)生产NO所需的四氢生物蝶呤(BH4)。在本报告中,我们提出了一种优化的方案,通过降低外源性生物蝶呤的水平来控制NO-氧化还原环境,同时保持适合细胞生长和分化的条件。严格控制培养基组成有助于确保实验可重复性,并有助于准确解释结果。在该协议中,BMDM是从GTP环水解酶(GCH)缺陷小鼠模型中获得的。BMDM的培养使用含有(i)条件LCM或(ii)重组M-CSF和GM-CSF的培养基进行,以产生最小的伪影,同时获得BH4和NO缺陷培养条件 – 从而允许在 体外对NO-氧化还原生物学和免疫代谢进行可重复的研究。
巨噬细胞已被确定为各种疾病和病症中一种有趣的细胞类型,其中许多似乎与它们对先天免疫的传统关注无关。由于巨噬细胞生理学严重依赖于它们所居住的组织或环境,因此已经出现了许多方法来和模型来研究它们的功能和所涉及的各种途径。从历史上看,巨噬细胞系,如RAW264.7,主导了该领域,但这些细胞系已经逐渐被各种原代细胞模型所取代。例如,在用巯基乙酸盐治疗后,可以从腹膜灌洗中分离出鼠巨噬细胞。在为组织驻留细胞的研究提供有用模型的同时,这些腹膜巨噬细胞已被证明对各种外部刺激表现出更温和的反应,从而限制了它们对许多下游应用的适用性1。
作为替代方案,源自骨髓中骨髓祖细胞的骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)已成为研究巨噬细胞生物学各个方面的宝贵模型,包括成熟以及与巨噬细胞相关的各种经典表型,M0(幼稚,非活化),M1(促炎,通常用LPS / IFN激活)和M2(前分辨率,通常用IL-4激活)2,3.然而,骨髓祖细胞分化为BMDM取决于培养基4,5中巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的存在。这可以以添加到培养基中的纯化蛋白质的形式提供,也可以从L929条件培养基(LCM)中提供。必须权衡使用BMDM的优势(成本和效率)及其对各种刺激(细胞因子,代谢中间体和RNS / ROS)的敏感性所带来的局限性。
先前的数据表明,LCM的含量定义不明确且具有内在可变性,导致它们不可靠且不适合各种下游应用,特别是那些与NO或氧化还原生物学特别相关的应用,因为这些应用可能受到外源化合物6存在的严重影响。因此,这个详细的方案要求使用定义明确的DMEM:具有低批次间变异的F12培养基,并添加重组小鼠M-CSF和GM-CSF(粒细胞 – 巨噬细胞集落刺激因子)。此外,通常用作组织培养基补充剂的胎牛血清提供了定义不明确的化合物和固有变异性的另一个来源。因此,有必要控制和优化此类添加剂的使用,以确保BMDM的可靠培养。通过使用定义的FBS低内毒素来源并确保批量购买单批次,可靠地定义培养条件并确保可重复性。本文描述的方案已被证明在通过流式细胞术6评估巨噬细胞表面标志物CD45和CD11b时产生纯度高于95%的巨噬细胞培养物。
这种BH4和NO缺陷BMDM培养方案旨在通过减少四氢生物蝶呤(BH4)和其他干扰伪影来研究初级巨噬细胞中的NO氧化还原生物学,以提高从这些实验模型获得的结果的可靠性和可重复性。
关键步骤包括使用正确的塑料器皿。巨噬细胞祖细胞是贴壁细胞,非常粘稠;因此,使用非组织培养(TC)处理的板对于选择和分离它们与其他祖细胞至关重要,否则这些祖细胞可能会附着并降低纯度。在收获当天,从平板中分离巨噬细胞需要冰冷的PBS,但根据下游应用(例如,裂解与活细胞实验),可以使用EDTA甚至非常温和地刮除细胞。还应特别注意污染。在冲洗骨髓时,可能会发生与残留的皮毛和皮肤中的细菌或病毒颗粒的潜在交叉污染。因此,必须尽可能小心和无菌;因此,鼓励将解剖的腿在70%乙醇中切开几分钟。同样,强烈建议在生长巨噬细胞时使用抗生素。
该方案的另一个限制源于第0天的细胞接种密度。冲洗的骨髓含有多种细胞,这些细胞可能被错误地计数并作为巨噬细胞祖细胞包括在内,从而导致错误的总细胞数。为了避免随后和潜在的变异性,可以在第7天使用温热的PBS轻轻冲洗分离的巨噬细胞,并在刺激前至少1小时以正确的密度在2%FBS DMEM:F12中重新接种,以允许依从性。
最后,使用来自生长的巨噬细胞的培养基通过Griess测定来检查亚硝酸盐水平对于分析数据至关重要。从好的方面来说,这种测定是快速和廉价的。
如本文所示,该定制方案是用于使用L细胞条件培养基(LCM)分离和培养巨噬细胞的更常见方案的更明确和改进的替代方案。事实上,在研究NO-氧化还原生物学时,使用LCM的主要问题之一是其检测到的大量生物蝶呤,从而导致潜在的代谢变化10。例如,外源性BH4可以快速补充有缺陷的模型,并作为iNOS的辅助因子,导致不需要的一氧化氮产生。使用LCM的另一个缺点在于其生产 – LCM是L-929细胞直接分泌的集落刺激因子,细胞因子和其他副产物的混合物,这些副产物都可以影响巨噬细胞生理学6。尽管M-CSF的供应量很大,对巨噬细胞增殖和存活至关重要,但每种组分在批次之间的变化增加了实验之间变异性的风险。
为了解决这两个问题,这个新方案使用定义明确的DMEM:含有低水平生物蝶呤的F12培养基,其中添加了控制量的纯化的M-CSF和GM-CSF。两种细胞因子都有助于巨噬细胞的分化和生长。M-CSF通过确保造血干细胞分化为巨噬细胞11,特别导致骨髓祖细胞产生BMDM。此外,GM-CSF已被证明在刺激之前添加时可以促进炎症细胞因子和NO的产生,这在研究NO-氧化还原生物学时具有真正的益处12,13。
这种新方法解决的另一个主要因素是FBS,通常用作细胞健康和生长所必需的营养素来源。与LCM类似,FBS含有显着水平的生物蝶呤。虽然最初考虑使用OptiMEM + 0.2%BSA在刺激前完全血清饥饿细胞,但巨噬细胞显示出脱离的迹象,表明Beliley等人所描述的细胞活力下降。然而,由于巨噬细胞表现出对血清的绝对需求,因此选择了BioWest的超低内毒素FBS。在批量购买之前,对批次进行生物蝶呤测试并预先选择,以确保可靠和明确的供应。为了进一步减少生物蝶呤的污染源,因此测试了FBS浓度的降低。FBS水平不是像细胞培养中常用的那样使用10%的血清,而是在骨髓分化为巨噬细胞的整个7天过程中保持为5%,并在最后一天的夜间刺激期间进一步降低至2%。这确保了检测到的生物蝶呤水平可以忽略不计,但有足够的营养物质来维持巨噬细胞的良好健康和依从性。尽管这种使用重组M-CSF的新优化方案为原代巨噬细胞的培养和活化提供了更可控的环境,但主要限制是该方法比使用LCM方法更昂贵。
考虑到所有这些因素,然后直接比较了这两种方法。重要的是,本文提出的使用重组M-CSF和GM-CSF的新修饰方案导致了一个更具可重复性的系统,其中培养基没有污染BH4。这样做的影响是双重的。BH4缺陷细胞确实缺乏BH4,这导致LPS刺激至M1状态后培养基中可检测到的亚硝酸盐积累最小。这与在LCM中培养的BMDM细胞形成鲜明对比,其中检测到显着的BH4和亚硝酸盐。
总而言之,这种方法的优势在于通过彻底评估可能影响巨噬细胞中NO和氧化还原信号传导的每个参数来控制生物蝶呤水平。特别是,这确保了NO-氧化还原生物学领域的最大可重复性和标准化。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了英国心脏基金会中级奖学金的支持,授予M.J.C.(FS/14/56/31049),英国心脏基金会计划赠款(RG/17/10/32859和RG/12/5/29576),惠康信托基金(090532/Z/09/Z)和NIH研究(NIHR)牛津生物医学研究中心。作者还想感谢牛津大学BHF卓越研究中心的支持(RE/13/1/30181和RE/18/3/34214)
1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |