Nous présentons ici le test de libération du médiateur, utilisant une lignée cellulaire de leucémie basophile de rat transfectée avec le récepteur IgE humain, pour simuler la dégranulation des cellules effectrices généralement observées dans les réactions allergiques de type 1. Cette méthode étudie l’activité biologique des allergènes d’une manière très sensible, reproductible et personnalisable.
Les tests de libération de médiateurs analysent la dégranulation médiée par l’immunoglobuline E (IgE) in vitro et la sécrétion de médiateurs par les cellules effectrices, telles que les mastocytes et les basophiles, lors de la stimulation avec des dilutions en série d’allergènes putatifs. Par conséquent, ces tests représentent un outil essentiel qui imite le processus de dégranulation in vivo, qui se produit lors de l’exposition aux allergènes chez les patients sensibilisés ou dans les tests cutanés. De plus, ces tests sont généralement utilisés pour étudier le potentiel allergène des protéines et la réactivité des sérums des patients. Ici, nous décrivons un protocole simple de 2 jours utilisant une lignée cellulaire de leucémie basophile de rat immortalisée transfectée et humanisée avec le récepteur de membrane plasmique IgE à haute affinité humaine (FcεRI). Cette variante du test de libération du médiateur est un système cellulaire in vitro robuste, sensible et reproductible sans qu’il soit nécessaire d’immobiliser l’antigène en matrices solides. Le protocole comprend les étapes suivantes: (1) l’inactivation du complément du sérum humain, (2) la récolte, l’ensemencement et la sensibilisation passive des cellules, (3) la stimulation par l’antigène pour provoquer la libération du médiateur, et (4) la mesure de l’activité de la β-hexosaminidase comme substitut des médiateurs inflammatoires libérés, tels que l’histamine. Le test représente un outil utile pour évaluer la capacité de la réticulation allergène-IgE à déclencher la dégranulation cellulaire et peut être mis en œuvre pour normaliser les extraits d’allergènes, pour comparer la réactivité des patients aux allergènes mineurs ou majeurs et aux extraits allergènes (pollen, squames de chat, etc.), pour étudier la puissance des homologues d’allergènes, des isoformes et des variantes de plis (par exemple, l’hypoallergénicité), ainsi que les effets des ligands sur l’activité allergène. Une application plus récente comprend l’utilisation du test pour surveiller l’efficacité du traitement au cours de l’immunothérapie allergénique.
Les réactions d’hypersensibilité de type I, caractérisées par la production d’immunoglobuline E (IgE) spécifique d’un antigène respectif, affectent près d’un tiers de la population mondiale. Ces réactions sont associées à plusieurs manifestations allergiques telles que l’asthme et la rhinoconjonctivite et peuvent même entraîner des réactions systémiques potentiellement mortelles1. Contrairement aux tests in vivo, les approches immunochimiques, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA), conviennent uniquement à l’étude de la liaison cible des anticorps, mais ne traitent pas de l’aspect fonctionnel des protéines pouvant provoquer des réactions immédiates d’hypersensibilité. L’immobilisation des allergènes sur des supports solides (p. ex. plaques ELISA) pourrait entraîner des changements dans leur intégrité structurale et la destruction des épitopes pertinents pour l’allergie2. Même les tests cutanés (SPT), l’outil le plus courant pour confirmer la sensibilisation contre certains allergènes, ont leurs limites concernant la détection d’une allergie alimentaire symptomatique médiée par les IgE ou la disponibilité des allergènes3,4. Afin de trouver une méthode éthique, très spécifique, sensible et rentable pour tester la puissance biologique des allergènes à provoquer une réaction d’hypersensibilité de type I, les tests dits de libération de médiateur ont été établis.
Le principe de ces essais repose sur les événements qui suivent la phase de sensibilisation et la capacité des IgE qui l’accompagne à se lier à la chaîne α des récepteurs de haute affinité exprimés à la surface des cellules effectrices, tels que les mastocytes et les basophiles. Les IgE sont principalement produites par les plasmocytes dans le tissu lymphoïde associé aux muqueuses. Bien qu’il s’agisse de l’immunoglobuline la moins abondante (environ 0,05% chez les personnes non atopiques) dans le sang, elle possède une activité biologique extraordinairement élevée étant la principale cause des symptômes allergiques. La demi-vie des IgE peut augmenter de 2-3 jours à plusieurs semaines et même des mois lorsqu’elle est liée à ses récepteurs sur les cellules effectrices. La liaison ultérieure d’un antigène à la région variable de deux molécules IgE liées aux récepteurs conduit à leur réticulation suivie de l’induction d’une cascade de signalisation en aval dans la cellule effectrice conduisant à la dégranulation et à la libération de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires provoquant une vasodilatation, tels que l’histamine, les protéases de sérine (par exemple, la tryptase) et les prostaglandines5,6,7. La sécrétion de cytokines telles que l’interleukine 4 (IL-4) et l’IL-13 est responsable du maintien de la réponse inflammatoire T helper 2 (Th2) et du changement de classe des lymphocytes B en plasmocytes producteurs d’IgE5,8,9. D’autre part, le thromboxane libéré provoque une bronchoconstriction, et les leucotriènes stimulent la contraction des muscles lisses ainsi que les fuites vasculaires, et jouent un rôle crucial dans l’inflammation des voies respiratoires conduisant à l’asthme ou à la rhinite allergique10,11.
Des outils de recherche pour analyser la plupart des médiateurs susmentionnés ont été mis en place, bien qu’avec quelques inconvénients majeurs. Les tests de tryptase sont des approches cliniques appropriées pour la mesure de l’anaphylaxie systémique par activation des mastocytes, mais leur sensibilité et leur spécificité dans les diagnostics d’allergie sont trop imprécises par rapport aux méthodes de référence telles que le SPT. D’autre part, les tests de kystéinyl leucotriène ne sont pas capables de diagnostiquer les allergies aux β-lactamines ou aux anti-inflammatoires non stéroïdiens12. Des protocoles pour la mesure de l’histamine en tant que médiateur majeur libéré dans les réactions allergiques ont déjà été établis dans les années 1960. Une fois libérée dans le sang périphérique, l’histamine est immédiatement dégradée par les histamine méthyltransférases, ce qui entraîne une demi-vie plasmatique de seulement quelques minutes, ce qui rend son analyse assez difficile13. Outre son instabilité, il a été démontré que la surveillance de l’histamine avait une faible spécificité et sensibilité pour les allergies médicamenteuses ainsi que pour les protéines alimentaires commerciales et les venins de guêpes12.
Des modèles in vitro avec des lignées cellulaires effectrices ont été introduits comme alternative aux procédures laborieuses d’isolement et de culture de basophiles de patients allergiques pour effectuer des tests de libération. Par conséquent, le test basé sur la leucémie basophile chez le rat (RBL-) utilisant la lignée cellulaire RBL-2H3 a été établi3. Étant donné que cette lignée cellulaire n’est pas capable de lier les IgE humaines, elle a d’abord été transfectée avec la chaîne α, β et γ du récepteur de la membrane plasmique IgE humaine (FcεRI). Plusieurs clones ont été générés et testés pour les niveaux d’expression et l’homogénéité de la chaîne α humaine, dont le clone RBL-30/25 est apparu comme le candidat le plus prometteur pour les tests in vitro. La cascade de signalisation induite lors de l’activation du récepteur du clone transfecté a été testée par des tests de mobilisation du calcium. En tant qu’indicateur de dégranulation et substitut de la libération d’histamine, l’enzyme lysosomale β-hexosaminidase a été mesurée, ce qui présente l’avantage significatif d’une plus grande stabilité14. La libération du médiateur à l’aide de cellules RBL-30/25 atteint jusqu’à 100% et est donc utilisée pour tester les sérums dérivés de patients allergiques. Le test a été testé pour la libération du médiateur après avoir mis au défi les cellules sensibilisées avec des extraits d’allergènes commerciaux. Cela a conduit à la découverte qu’il existe une énorme variation dans la composition (jusqu’à 60 fois par rapport à la teneur totale en protéines) des extraits d’allergènes dérivés de différents fabricants et utilisés pour le diagnostic (par exemple, SPT) ou les approches thérapeutiques3,15,16.
Ici, nous fournissons une description détaillée du protocole RBL pour effectuer le test de libération du médiateur en utilisant le sérum de donneurs allergiques. Lors de la sensibilisation passive, les IgE dans le sérum sont capturées par le récepteur FcεR1 de haute affinité exprimé à la surface des cellules basophiles. Lors de la stimulation de l’antigène, les IgE liées spécifiques à l’antigène sont réticulées, déclenchant la dégranulation cellulaire et la libération du médiateur β-hexosaminidase. L’activité de la β-hexosaminidase est ensuite mesurée à l’aide d’un substrat approprié. Pour le test, des cellules huRBL-2H3 ont été utilisées et appelées huRBL dans le protocole suivant. Le protocole décrit une série standard de dilution d’antigène avec 8 étapes diluées 1:10 allant de 1 μg/mL à 0,1 pg/mL d’allergène.
Le test de libération de médiateur à base de cellules huRBL décrit ici est une méthode robuste qui peut facilement être effectuée et mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire. La seule exigence est que les cellules doivent être cultivées dans des conditions stériles. Le test est utilisé pour évaluer la probabilité qu’un allergène ou une source allergène évoque la réticulation IgE et la dégranulation basophile des patients17. Le test peut facilement être adapté à n’importe quel allergène ou source allergène tant que le sérum du patient avec un niveau élevé d’IgE spécifiques, reconnaissant l’allergène d’intérêt, est disponible. Il est recommandé d’effectuer un test de viabilité cellulaire en plus du test de libération du médiateur afin de tenir compte de tout effet cytotoxique potentiel qui pourrait entraîner une mauvaise performance du test. Cela pourrait être dû à une inactivation incomplète du sérum par le complément ou à d’autres effets cytotoxiques dérivés du sérum. Même l’antigène lui-même, par exemple, en raison de l’activité protéolytique / enzymatique, peut nuire aux cellules huRBL. Nous utilisons habituellement un test de viabilité cellulaire avec mtT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) pour évaluer les effets cytotoxiques potentiels. Le test peut facilement être effectué avec les cellules huRBL laissées après la collecte et le transfert du surnageant cellulaire (voir l’étape 6.3. du protocole). Comparé à d’autres méthodes immunochimiques, telles que les ELISA et le Western Blotting, pour déterminer le potentiel allergène d’allergènes individuels ou d’extraits complexes basés sur la liaison allergène-IgE, ce test peut détecter non seulement la liaison des IgE à un allergène, mais peut également mesurer la fonctionnalité des IgE humaines et de l’allergène, pour provoquer une dégranulation basophile médiée par les IgE18. Ainsi, il peut aider à étudier la gravité des symptômes allergiques ex vivo en utilisant le sérum des patients. Le test serait plus cohérent et plus efficace que les tests d’anaphylaxie cutanée passive classiques, car le test utilise les cellules RBL-2H3, qui sont relativement faciles à manipuler et produisent moins de variabilité dans les résultats par rapport aux cellules primaires, telles que les mastocytes ou les basophiles humains19,20. En plus de cela, le test fournit une bonne représentation de l’activité biologique des allergènes et peut estimer avec précision la teneur totale en allergènes dans un échantillon complexe donné3. Pour résoudre certaines étapes du protocole, reportez-vous au Tableau 1.
En ce qui concerne l’applicabilité de cette version du test de libération du médiateur, elle a surtout été utilisée à des fins de recherche mais aussi pour la standardisation des extraits allergènes en fonction de leur activité biologique. Cela comprend l’analyse de différents lots de solutions SPT, solution de test de provocation, ainsi que des extraits utilisés pour l’immunothérapie spécifique à l’allergène; comme indiqué pour le pollen, les squames de chat, les acariens de la poussière domestique et les extraits d’arachide,ainsique le venind’abeille3 ,17,21. La technique peut être appliquée en particulier dans le diagnostic des allergies alimentaires, car elle peut détecter même des quantités minimes de constituants allergènes dans des produits alimentaires complexes tels que les arachides, le lait, le blé et les œufs22. À cet égard, il a également été signalé comme un outil précieux pour l’évaluation de l’allergénicité des allergènes alimentaires pour animaux, tels que les tropomyosines, et peut aider à distinguer les allergènes puissants des non-allergènes23. En tant qu’outil de recherche, le test est utilisé pour étudier l’impact de la transformation des aliments ainsi que pour évaluer l’influence de la liaison des ligands aux allergènes et son effet sur l’allergénicité24,25. Par exemple, il a été démontré que la liaison de Bet v 1 aux ligands n’affectait pas la réticulation allergène-IgE, bien qu’elle ait entraîné une augmentation de sa stabilité thermique et protéolytique25. Le test peut être utilisé pour comparer la réactivité du patient aux allergènes mineurs et majeurs, ainsi que pour étudier la réactivité croisée des homologues allergènes et des isoformes, comme le montre notre exemple en utilisant Bet v 1 et l’allergène alimentaire homologue Cor a 1(Figure 3). En ce qui concerne les isoformes allergènes, le test de libération du médiateur a été utilisé pour identifier l’allergène majeur Amb a 1.01 comme l’isoforme réactive IgE la plus puissante dans le pollen d’herbe à poux (Ambrosia artemisiifolia). En comparaison, les deux autres isoformes identifiées dans les extraits de pollen d’herbe à poux, Amb a 1,02 et Amb a 1,03, ont montré une réactivité réduite aux IgE26des patients.
Au cours des dernières années, le test a été appliqué pour étudier les composés anti-allergiques potentiels et les nouvelles variantes hypoallergéniques des allergènes, aidant à l’identification de candidats appropriés pour l’immunothérapie spécifique à l’allergène27,28. Une autre nouvelle approche consiste à utiliser le test pour surveiller l’efficacité du traitement au cours d’une immunothérapie spécifique à un allergène. À cet égard, notre groupe de recherche a développé un système d’inhibition du test huRBL, qui était bien corrélé avec la réduction du score symptomatique du patient au cours de l’immunothérapie spécifique à l’allergène29. Le test a également été proposé pour étudier les effets immunosuppresseurs de la TGFβ1 sur la dégranulation induite par les IgE induite par les allergènes30.
Les limites du test sont que même si les cellules huRBL possèdent certaines caractéristiques des mastocytes ou des basophiles, elles n’imitent pas complètement la fonction naturelle de ces cellules effectrices. Par exemple, les mastocytes expriment largement le récepteur de reconnaissance de formes Toll-like receptor 4 (TLR4), nécessaire à la reconnaissance des agents pathogènes, alors qu’il est complètement déficient dans les cellules RBL-2H331. En raison de cette différence de fonctionnalité, le test n’imite pas complètement la situation réelle, ce qui doit être gardé à l’esprit lors de l’interprétation des données. De plus, étant donné que les cellules huRBL sont des cellules basophiles cancéreuses, les changements dans les conditions de culture et la culture prolongée peuvent entraîner des différences phénotypiques conduisant à des résultats altérés entre différents laboratoires20. Un autre aspect est le choix de la concentration d’allergènes qui doit être pris en compte lors de l’adaptation de cette méthode car des concentrations élevées d’allergènes peuvent entraîner une dégranulation non médiée par les IgE en raison de la présence de grandes quantités de protéases ou d’endotoxines18. D’autres limites sont la dépendance aux sérums humains avec des niveaux d’IgE spécifiques relativement élevés (classe RAST 5-6), et la nécessité de systèmes de culture cellulaire, qui reste un obstacle à surmonter afin de mettre en œuvre la technique dans la routine clinique quotidienne.
En dehors de ces limitations, le test huRBL représente un outil de recherche précieux pour le diagnostic et le traitement des maladies allergiques et peut être utilisé dans un large éventail d’applications.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Prof. Dr. Stefan Vieths du Département d’allergologie moléculaire, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Allemagne, pour avoir fourni les cellules RBL humanisées / transfectées par FcεRI et pour avoir donné son consentement à la rédaction de cet article de méthodologie de recherche. Nous tenons à remercier prof. Dr. Fatima Ferreira pour avoir fourni d’excellents commentaires. Nous tenons également à remercier le Prof. Dr. Ronald van Ree et le Dr. Jaap Akkerdaas du Département d’immunologie expérimentale, Amsterdam University Medical Centers, situé AMC, Amsterdam, Pays-Bas, d’avoir donné leur consentement à la publication de données représentatives fournies dans ce document sur les méthodes, qui ont été générées dans le cadre du projet BM4SIT – innovations for allergy (www.BM4SIT.eu). Les travaux des auteurs ont été soutenus par le Fonds autrichien pour la science (Projet P32189), par le programme prioritaire Allergy-Cancer-BioNano Research Centre de l’Université de Salzbourg, par le programme doctoral Immunité contre le cancer et l’allergie-ICA financé par le Fonds autrichien pour la science (FWF W01213) et par le projet BM4SIT (numéro de subvention 601763) du septième programme-cadre FP7 de l’Union européenne.
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
Citric acid | Applichem | 131018 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
G418 | Sigma | A1720 | |
Glycine | Applichem | A3707 | |
Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |