Здесь мы описываем создание и применение линии репортеров Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (называемой αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) для оценки перепрограммирования сердца. Неонатальные сердечные фибробласты (NCF), выделенные из штамма мыши, превращаются в индуцированные кардиомиоциты (iCM), что позволяет удобно и эффективно оценивать эффективность перепрограммирования и функциональное созревание iCM через поток кальция (Ca2+).
Перепрограммирование сердца стало потенциально перспективной терапией для восстановления поврежденного сердца. Путем введения нескольких факторов транскрипции, включая Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), фибробласты могут быть перепрограммированы в индуцированные кардиомиоциты (iCM). Эти iCM, генерируемые in situ в инфарктном сердце, электрически и механически интегрируются с окружающим миокардом, что приводит к уменьшению размера рубца и улучшению функции сердца. Из-за относительно низкой эффективности перепрограммирования, чистоты и качества iCM характеристика iCM остается проблемой. Используемые в настоящее время методы в этой области, включая проточную цитометрию, иммуноцитохимию и qPCR, в основном сосредоточены на сердечно-специфической экспрессии генов и белков, но не на функциональном созревании iCM. Запускаемое потенциалами действия, открытие кальциевых каналов в кардиомиоцитах приводит к быстрому притоку кальция в клетку. Поэтому количественная оценка скорости притока кальция является перспективным методом оценки функции кардиомиоцитов. Здесь протокол вводит метод оценки функции iCM по потоку кальция (Ca2+). Штамм мыши αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 был установлен путем скрещивания Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (далее именуемого Myh6-Cre) с Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (далее именуемым Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3). Неонатальные сердечные фибробласты (NCF) у неонатальных мышей P0-P2 были выделены и культивированы in vitro, а полицистронная конструкция MGT была введена в NCF, что привело к их перепрограммированию в iCM. Поскольку только успешно перепрограммированные iCM будут выражать репортер GCaMP3, функциональное созревание iCM может быть визуально оценено с помощью потока Ca2+ с помощью флуоресцентной микроскопии. По сравнению с неперепрограммированными NCF, NCF-iCM показали значительный переходный поток кальция и спонтанное сокращение, аналогичное КМ. Этот протокол подробно описывает создание штамма мыши, изоляцию и отбор сердца неонатальных мышей, изоляцию NCF, производство ретровируса для перепрограммирования сердца, индукцию iCM, оценку потока iCM Ca2 + с использованием нашей репортерной линии и соответствующий статистический анализ и представление данных. Ожидается, что методы, описанные здесь, обеспечат ценную платформу для оценки функционального созревания iCM для исследований сердечного перепрограммирования.
Инфаркт миокарда (ИМ) является тяжелым заболеванием во всем мире. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире и составляют около 18,6 миллиона смертей в 20191 году2. Общая смертность от ССЗ снизилась за последние полвека. Однако эта тенденция замедлилась или даже обратилась вспять в некоторых неразвитых странах1, что требует более эффективного лечения ССЗ. Как одно из смертельных проявлений ССЗ, им приходится около половины всех смертей, приписываемых ССЗ в Соединенных Штатах2. Во время ишемии, при блокировке коронарных артерий и ограниченном поступлении как питательных веществ, так и кислорода, миокард страдает от тяжелых метаболических изменений, ухудшает систолическую функцию кардиомиоцитов (КМ) и приводит к смерти ОТ СМ3. Были изучены многочисленные подходы в сердечно-сосудистых исследованиях для восстановления повреждения сердца и восстановления функции поврежденного сердца4. Прямое перепрограммирование сердца стало одной из многообещающих стратегий восстановления поврежденного сердца и восстановления его функции5,6. Вводя Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), фибробласты могут быть перепрограммированы на iCM in vitro и in vivo, и эти iCM могут уменьшить область рубца и улучшить работу сердца7,8.
Хотя перепрограммирование сердца является многообещающей стратегией для лечения ИМ, остается ряд проблем. Во-первых, эффективность перепрограммирования, чистота и качество не всегда так высоки, как ожидалось. Индуцирование MGT может достигать только 8,4% (cTnT+) или 24,7% (αMHC-GFP+) от общего количества CF, подлежащих перепрограммированию в iCM in vitro7, или до 35% in vivo8, что ограничивает его применение. Даже с большим количеством факторов, индуцированных в системе, таких как Hand29 или Akt1 / PKB10, эффективность перепрограммирования все еще едва ли удовлетворительна для использования в клинических условиях. Таким образом, в этой области необходимы дополнительные исследования, направленные на повышение эффективности перепрограммирования. Во-вторых, электрические характеристики целостности и сокращения iCM важны для эффективного улучшения функции сердца, но их сложно оценить. В настоящее время широко используемые методы оценки в этой области, включая проточную цитометрию, иммуноцитохимию и qPCR экспрессии некоторых ключевых генов CMs, сосредоточены на сходстве iCM и CM, но не связаны напрямую с функциональными характеристиками iCM. Кроме того, эти методы имеют относительно сложные процедуры и отнимают много времени. В то время как исследования перепрограммирования обычно включают скрининг потенциальных факторов перепрограммирования, которые способствуют созреванию iCM11, перепрограммирование сердца требует быстрого и удобного метода, основанного на функции iCM.
CMs открывают напряженные ионные каналы кальция на цитомембране во время каждого цикла сокращения, что приводит к переходному притоку иона кальция (Ca2+) из межклеточной жидкости в цитоплазму для участия в сокращении миофиламента. Такой цикл притока и оттока Ca2+ является фундаментальной чертой сокращения миокарда и составляет нормальную функцию CMs12. Таким образом, метод, который обнаруживает приток Ca2+ , может быть потенциальным способом измерения функции CM и CM-подобных клеток, включая iCM. Кроме того, для iCM такой метод обеспечивает еще один способ оценки эффективности перепрограммирования.
Генетически закодированные показатели кальция (GECI) были разработаны и широко используются для указания активности клеток, особенно потенциалов действия. Как правило, GECI состоят из домена связывания Ca2+ , такого как кальмодулин, и флуоресцентного домена, такого как GFP, а GCaMP3 является доменом с высокой аффинностью и интенсивностью флуоресценции. Флуоресцентный домен GCaMP3 будет активирован при изменении местной концентрации кальция13. В этой статье описан штамм мыши, который специфически экспрессирует репортер GCaMP3 в клетках Myh6+. Вводя MGT в изолированные NCF от новорожденных этого штамма, перепрограммирование можно контролировать флуоресценцией, которая будет проявляться успешно перепрограммированным iCM. Такой штамм и метод мыши обеспечат ценную платформу для исследования сердечного перепрограммирования.
Оценка функции iCM необходима для поля перепрограммирования сердца. В этой рукописи протокол описывает установленный штамм мыши Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J, как использовать NCF, выделенные от неонатальных мышей в этом штамме, для перепрограммирования на iCM и оценки функции iCM по ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы высоко ценим усилия Льва Гнатовского в редактировании английского текста этой рукописи. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Это исследование было поддержано грантом Национального института здравоохранения (NIH) США (1R01HL109054) доктору Вану.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |