5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila
Summary
ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.
Abstract
In vivo ניתוח התקדמות מחזור התא מבוצע באופן שגרתי במחקרים על גנים המסדירים מיטוזה ושכפול DNA. 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) נוצל כדי לחקור התקדמות שכפול/ S-פאזה, בעוד נוגדנים נגד פוספו-histone H3 נוצלו כדי לסמן גרעינים מיוטיים ותאים. שילוב של שתי התוויות יאפשר סיווג של של שלב G0/G1 (שלב פער), S (שכפול) ו- M (מיטוטי) וישמש ככלי חשוב להערכת ההשפעות של נוקאאוטים גנטיים מיוטיים או מוטציות ריקות על התקדמות מחזור התא. עם זאת, ריאגנטים המשמשים לסימון תאים המסומנים על-ידי EdU אינם תואמים למספר תגי נוגדנים-פלואורסצנטיים משניים. זה מסבך חיסונים, שבו נוגדנים משניים ראשוניים ומתויגים משמשים לסימון תאי מיטוט חיוביים pH3. מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב לתיוג כפול של EdU ו- pH3 בתאי גזע עצביים זחל Drosophila, מערכת בשימוש נרחב כדי לחקור גורמים מיוטיים. בנוסף, פרוטוקול מסופק לניתוח וכימות תמונה כדי להקצות תאים מסומנים ב-3 קטגוריות נפרדות, של שלבים G0/G1, S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלבי M.
Introduction
מחזור חלוקת התאים כולל שלב G1 (שלב הפער הראשון), שלב שכפול/S, G2 (שלב פער שני) ושלב M (מיטוטי). עובר בשלבים אלה, התא עובר שינויים דרמטיים תמלול הסלולר, תרגום, וארגון מחדש של מכונות שלד1,2. בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים, תאים עשויים להפסיק באופן זמני להתחלק ולהיות ססגוניים (G0) או להבדיל ולהפסיק לצמיתות לחלק3. תרחישים אחרים, כגון נזק לדנ”א, עלולים לגרום לבידול מוקדם או אפופטוזיס3,4. התגובה לרמזים כאלה מתווכת על ידי מחסומי מחזור סלולריים, הפועלים כמערכת מעקב כדי להבטיח את שלמותם של תהליכים סלולריים חיוניים לפני שהתא מתחייב לשלב הבא של מחזור החלוקה5. לכן, מחקרים על גנים המסדירים שכפול DNA, מחסומים ומכונות מיטוטיות צריכים לנתח פגמים אפשריים בהתקדמות מחזור התא שעלולים להתרחש בתאים מוטנטיים או על פירוק siRNA של גנים אלה. בנוסף, ניתוחים כאלה עשויים להיות מועסקים כדי לבדוק את בריאות התא הכוללת, כמו גם תגובות תאיות לטיפול תרופתי.
5-ברומו-2′-דאוקסיאורידין (BrdU) הוא אנלוגי תימידין המשולב ב- DNA במהלךשכפול 6. שיטה זו שימשה בהרחבה לזיהוי תאים ב- S-phase. עם זאת, התאים נתונים לאחר מכן להליכי דנ”א קשים כדי לאפשר זיהוי של BrdU באמצעות נוגדנים נגד BrdU6. טיפול קשה זה עלול לפגוע באפיטופים הסלולר ולמנוע אפיון נוסף של המדגם באמצעות חיסונים. שילוב EdU וזיהוי לאחר מכן על ידי נחושת מזורז, “תגובת קליק” עם קטן, תא חדיר, צבעי אזיד מתויגים באופן פלואורסצנטי מבטל את הצורך בהליכי דנטורציה קשים7. שיטה זו, אם כן, התגלתה כחלופה מעשית יותר לתאגדות BrdU.
יתר על כן, pH3 תואר כסמן אמין עבור mitotic / M פאזה תאים8. Histone H3 הוא חלבון היסטון ליבה הקשור לדנ”א שהופך לזרחן בסביבות שלב ה- G2 המאוחר לשלב M המוקדם והוא דה-זרחן לקראת סוף אנאפאזה8. מספר נוגדנים מסחריים ניתן להשתמש כדי לזהות pH3 באמצעות פרוטוקולים חיסוניים סטנדרטיים. מכתים כפול של EdU ו- pH3 יאפשר אפוא זיהוי של תאים ב- S-phase כמו גם M-phase. בנוסף, תאים בשלב G1 ו- G2 מוקדם לא יכתימו באופן חיובי עבור אף אחד מהסמנים.
תאי גזע עצביים Drosophila או neuroblasts (NBs) מציעים מודל תאי גזע מאופיין היטב שבו תאים מתחלקים באופן אסימטרי כדי לייצר NB אחד זהה מתחדש עצמי ותא אם גנגליון (GMC), אשר נגזר על בידול9. בנוסף, מספר כלים גנטיים ונוגדנים ספציפיים ל- NB הופכים את המערכת הזו למתאים למניפולציה גנטית והדמיה של תאים חיים. כתוצאה מכך, מספר מחקרים השתמשו NBs כדי לחקור גנים המסדירים חטיבות אסימטריות וקביעת גורל התא9. אוכלוסיות נפרדות של NBs קיימות במוח המרכזי (CB) ובאונה האופטית (OL) של המוח הזחלי9; CB NBs שימשו למחקר הנוכחי. אלה NBs CB זחל השלישי הם תאים גדולים המתאימים גם לחקר גורמים המסדירים את הרכבת ציר מיטוטי. פרוטוקול לניתוח פגמים התקדמות מחזור התא יהיה כלי חיוני במחקרים כאלה.
פרוטוקולים שפורסמו קודם לכן השתמשו בערכות מסחריות, כגון Click-iT EdU Alexa Fluor Cell התפשטות ערכה, המספקים מספר רכיבי תגובה וצבעי אזיד מתויגים עם מגוון של צבעי Alexa Fluor עבור שילוב וזיהויEdU 10. עם זאת, ריאגנטים המסופקים עם ערכות כאלה אינם תואמים כמה תגי פלורסנט המשמשים לעתים קרובות עם נוגדנים משניים. ערכת זיהוי EdU זו (ערכת התפשטות תאי EdU של Click-iT Alexa Fluor שסופקה עם אלכסה פלור 647-מצומד צבע אזיד) נבדקה ב- Drosophila שלישי זחל זחל NBs, וכתמים שותפים נוסה עם נוגדנים נגד pH3 ומירנדה, סמן עבור NBs. יתר על כן, אלכסה פלור 568- או Cy3 מתויג נוגדנים משניים שימשו לגילוי של מירנדה תיוג על קרום הפלזמה של NBs11. עם זאת, עוצמת האות הצפויה ודפוס הכתמים (תוצאות שלא פורסמו) לא נצפו עם נוגדנים משניים אלה כאשר חיסון בוצע לאחר זיהוי EdU.
עבור שילוב EdU, הפרוטוקול המתואר על ידי דאול ועמיתיו נדרש האכלה של הזחלים עם בינוני קנקל-לבן מעורבב עם EdU ו ברומופנול כחול (BPB)10. הזחלים ניזונים ממזון EdU ו- BPB, אשר ניתן לראות על ידי צבעו הכחול על בליעה במעיים הזחל. למרות שיטה זו שימשה לשילוב EdU ב Mms19 אובדן פונקציה (Mms19P)זחלי instar השלישי, זחלי Mms19P כנראה לא להאכיל כמו כמעט כל צבע כחול זוהה במעיים זחל (תוצאות שלא פורסמו). זחלי Mms19P מראים עיוותים התפתחותיים דרסטיים ובסופו של דבר נעצרים בשלב האינסטאר השלישי. זה עשוי איכשהו להשפיע על התנהגות ההזנה של זחלי instar השלישי ולהפוך את פרוטוקול האכלת EdU לא מתאים במקרים כאלה.
לאחר שלמד את הספרות הזמינה ועבד בהרחבה על התקינה של צעדים חיוניים, הוצעה גישה חלופית עבור EdU / pH3 תיוג כפול ב- Drosophila NBs, אשר אינו דורש האכלת EdU לזחלים. מחקר קודם השתמש כפול EdU / pH3 כתמים כדי לנתח את מחזור התא ב NBs, אבל לא הציג פרוטוקול מפורט4. זה מהווה משוכה מיותרת למעבדות המנסות ליישם שיטה זו. יתר על כן, הערכת התאימות של ריאגנטים שונים עם ערכת EdU וביצוע אופטימיזציה נוספת יכול להיות תהליך גוזל זמן. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב המכסה שילוב EdU במוחות זחלים ניתחו וחיסון עם נוגדנים נגד pH3, ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה כדי להקצות NBs לארבע קטגוריות נפרדות: שלב G0 / G1, שלב S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלב M. השלבים הזקוקים למיטוב מפורטים ועצות הניתנות לניתוח תמונה של ערכות נתונים גדולות. בנוסף, הקריאה EdU /pH3 ב- NBs מסוג פראי מנותחת ומושוות ל- Mms19P NBs, אשר דווחו לאחרונה כדי להראות עיכוב מחזור התא11.
Protocol
Representative Results
Discussion
התאגדות EdU ותגובת ה’קליק’ הבאה שלה עם אזיד חדיר לתא מציגה יתרונות מעשיים של טכניקה זו על פני שיטת BrdU בשימוש מוקדם יותר7. עם זאת, תגובה זו מזורזת על ידי יונים Cu(I), וכמה צבעים עשויים להיות לא יציבים בנוכחות זרז נחושת זה, כפי שמומלץ בבירור על ידי יצרן ערכת EdU קליק-אי. כאשר ניסויי חיסון …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה במימון הקרן הלאומית למדע השוויצרית (מענק פרויקט 31003A_173188; www.snf.ch) ואוניברסיטת ברן (www.unibe.ch) ל- BS. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
